Что такое репликация вируса гепатита в

Биология и медицина

Гепатит B: динамика появления антигенов и ДНК вируса

При заражении вирусом гепатита В HBsAg ( рис. 295.4 ) появляется в крови первым, за несколько недель до начала симптомов и повышения активности аминотрансфераз, и исчезает через 1-2 мес после возникновения желтухи (изредка он сохраняется более 6 мес). После исчезновения HBsAg в крови появляются антитела к нему (анти-HBs), которые обычно сохраняются до конца жизни.

HBcAg располагается под внешней оболочкой вируса, поэтому его невозможно обнаружить в сыворотке, но антитела к нему выявляются в сыворотке уже через 1-2 нед после появления HBsAg , за несколько недель или месяцев до появления антител к HBsAg . От исчезновения HBsAg до появления антител к нему иногда проходит несколько недель и даже больше. В этот «период окна» признаком текущей или перенесенной инфекции служат антитела к HBcAg . Переливание крови, содержащей антитела к HBcAg в отсутствие HBsAg и антител к HBsAg , может привести к развитию посттрансфузионного гепатита В . Впрочем, отчасти благодаря появлению более чувствительных методов определения HBsAg и антител к HBsAg с «периодом окна» теперь приходится сталкиваться намного реже. Иногда антитела к HBcAg обнаруживают даже через несколько лет после перенесенного гепатита В, когда антитела к HBsAg уже исчезают. Поэтому выявление антител к HBcAg необязательно говорит о репродукции вируса; обычно это признак давно перенесенного гепатита В.

Иногда наблюдаются перекрестные и ложноположительные реакции.

Давность инфекции можно оценить, определив класс антител к HBcAg : при остром гепатите В и в течение приблизительно 6 мес после него, в том числе в «период окна», преобладают IgM , а в дальнейшем (в том числе при хроническом гепатите В ) — IgG . У 1-5% больных острым гепатитом В концентрация HBsAg находится ниже порогового уровня, и поставить диагноз можно только по наличию IgM-антител к HBcAg . Изредка при хроническом гепатите В выявляют только IgG-антитела к HBcAg в отсутствие HBsAg (концентрация последнего находится выше порогового уровня).

По-видимому, антитела к HBsAg являются протективными, так как их появление по времени совпадает с выздоровлением, а у лиц, у которых в крови обнаруживаются эти антитела, никогда не происходит повторного заражения гепатитом В. Поэтому основная задача профилактики гепатита В — создание достаточного титра антител к HBsAg в крови у лиц из группы риска.

Другой легко выявляемый маркер вирусного гепатита В, HBeAg , появляется в крови одновременно с HBsAg или чуть позже. Появление HBeAg , вирусной ДНК и ДНК-полимеразы в крови свидетельствует о высокой скорости репродукции вируса и его выходе в кровь. Кроме того, репродукция вируса сопровождается выходом в кровь большого и среднего поверхностных белков, но их можно выявить только с помощью специальных методов.

Если болезнь не переходит в хроническую форму, HBeAg исчезает раньше, чем HBsAg , вскоре после того, как активность аминотрансфераз достигает максимального уровня и появляются антитела к HBeAg ( рис. 295.4 ); заразность больного в этот период снижается. При остром гепатите В маркеры репликации появляются в крови лишь на короткое время, поэтому их определение имеет диагностическое значение в основном при хроническом гепатите ( рис. 295.5 ).

На ранней, репликативной, стадии хронического гепатита вирусная ДНК обнаруживается как в сыворотке, так и в ядрах гепатоцитов (в виде эписомы); в крови циркулируют все 3 вида вирусных частиц. В это время активность гепатита и заразность больного максимальны.

HBeAg является качественным, а вирусная ДНК — количественным показателем репликации вируса. Постепенно темп репликации снижается, и хронический гепатит переходит в латентную, или интегративную, стадию. Ежегодно это происходит у 10% больных. При этом HBeAg исчезает и появляются антитела к нему, то есть происходит сероконверсия. У большинства больных она сопровождается преходящим повышением активности аминотрансфераз, по-видимому, в результате разрушения зараженных гепатоцитов сенсибилизированными лимфоцитами. На этой стадии геном вируса интегрирован в ДНК гепатоцита и наблюдается синтез HBsAg . В крови циркулируют только сферические и нитевидные частицы, а частиц Дейна не бывает. Активность гепатита снижается. Таких людей не совсем точно называют носителями вируса гепатита В. На самом деле строго разграничить репликативную и интегративную стадии невозможно, так как, используя ПЦР и другие высокочувствительные методы амплификации нуклеиновых кислот, в интегративной стадии все же можно выявить репликацию вируса. Однако такая классификация имеет клиническое и патофизиологическое значение.

Иногда интегративная стадия может снова переходить в репликативную, при этом развивается обострение гепатита и в крови снова появляются HBeAg и вирусная ДНК.

Особенности репликации вируса гепатита В.

Любые студенческие работы — ДОРОГО!

100 р бонус за первый заказ

Вирионы гепатита В (частицы Дейна) сферической формы с диаметром 42—45 нм. Они состоят из сердцевины диаметром 27 нм, содержащей вирусную двунитчатую кольцевую ДНК, окруженную мембраной толщиной 2 нм; сердцевина окружена внешней липопротеидной оболочкой толщиной 7 нм. Наряду с полноценными вирионами встречаются в гораздо большем количестве частицы, состоящие лишь из фрагментов наружной оболочки. Они могут быть сферическими с диаметром 16—25 нм и нитевидными с диаметром 10—20 нм и длиной до 700 нм. Нитевидные структуры являются агрегатами сферических частиц. Частицы содержат поверхностный антиген вируса — HBs-антиген и накапливаются в результате избыточной продукции поверхностного компонента частиц Дейна. Частицы HBs антигена не обладают инфекционной активностью, однако, они являются маркером на возможное присутствие частиц Дейна в исследуемом материале.

Гепатит В (гепабновирус) — подгруппа ДНК-содержащих вирусов, содержащих двунитевую ДНК.

Геном данного вируса представлен кольцевой молекулой ДНК, которая не является ковалентонозамкнутой молекулой ДНК, а имеется линкер, обеспечивающий закольцовывание. Причём одна из нитей имеет разрывы, т.е. несплошная, и стабилизация всей геномной молекулы обеспечивается второй нитью, которая не имеет разрывов. В составе вирусной частицы вируса гепатита В имеется фермент- ДНК-полимераза, которая обеспечивает достраивание разодранной нити до цельной нити и формирование двунитевой молекулы ДНК, которая транскрибируется с образованием РНК-продуктов двух типов:

  • РНК одного класса служит в качестве иРНК для синтеза соответствующих белков;
  • РНК второго класса представляет собой своеобразные РНК-матрицы для синтеза геномной ДНК вируса гепатита В. Причём этот синтез геномной ДНК вируса гепатита В на РНК-матрице осуществляется обратной транскриптазой (для чего – не известно).

(вирус гепатита В является предраковым – рак печени).

Геном вируса гепатита В не встраивается в генном клетки и в,, отличие от ретровирусов не проходит стадию интермедиата ДНК в процессе репродукции. Если обнаруживаются в геноме клетки фрагменты генома вируса гепатита В, то эта ситуация является инициирующей для процесса превращения клетки в злокачественную. С этим связана онкогенная функция гепатита В.

Схема репродукции вируса гепатита Б (гепабновирусы)

Родительская геномная ДНК вируса имеет разрывы в одной нити, вторая нить стабилизирует эти структуры. Полимеризующие ферменты вириона на первых этапах репродукции обеспечивают заделывание этих брешей(репарацию) и превращение в двунитевую структуру молекулы ДНК. Эта молекула транскрибируется и возникает 2 класса РНК:

Первый класс – это «+» иРНК транслируется в белки, среди которых обратная транскриптапза, полимераза, специфическая иРНК(?), которая участвует в репликации ДНК. РНК второго класса, возникающая при транскрипции ,является матрицей для синтеза с помощью обратной транскриптазы двунитевой геномной ДНК, включающаяся вместе со структурными белками в образование зрелого потомства. В природе существует генно-инженерная вакцина против гепатита В, созданная по технологиям рекомбинатных ДНК. Автор вакцины – сэр Кент Мурей.

HBsAg: о чем говорит положительный результат анализа крови на антиген?

Качественное исследование на определение антигена (HBsAg) вируса гепатита B в крови может способствовать определению вируса на самых ранних стадиях его развития.

Определение антигена (HBsAg) вируса гепатита B в крови используется при лечении острого и хронического гепатита.

Задать интересующие вопросы и узнать больше об услугах лаборатории можно, записавшись на бесплатную консультацию.

Получить медицинские услуги можно без очередей и переплат!

Для того чтобы результаты анализов были максимально достоверными, необходимо правильно подготовиться к их сдаче.

Получить медицинские услуги не выходя из дома можно с помощью услуги «служба выезда на дом».

Сэкономьте на медицинских услугах, став участником специальной дисконтной программы.

Контроль качества клинических лабораторных исследований, осуществляемый по международным стандартам, – существенный аргумент в пользу медицинского центра.

Аббревиатура, приведенная в заголовке статьи, образуется от «Hepatitis B surface Antigen», что переводится как «поверхностный антиген вируса гепатита В». Его называют также «австралийским антигеном», поскольку впервые он был обнаружен в сыворотки крови у аборигенов Австралии. Выявление заболевания производится по присутствию и установлению концентрации HBsAg в крови при помощи серологических, иммуноферментных и радиоиммунных анализов.

Гепатит и HBsAg

Итак, антиген HBsAg – один из компонентов оболочки вируса гепатита В (HBV). В контексте лабораторных исследований он является маркёром (индикатором) вируса.

Если говорить о составе капсида (внешняя оболочка вируса) гепатита В подробнее, то это сложная комбинация белков, гликопротеинов, липопротеидов и липидов клеточного происхождения. HBsAg в данном случае отвечает за процесс адсорбции вируса клеткой, то есть обеспечивает поглощение HBV гепатоцитами – клетками печени. Как и любой другой вирус, после внедрения в благоприятную среду, он начинает реплицировать (продуцировать) новые ДНК и протеины, необходимые для дальнейшего размножения (копирования) вируса. Фрагменты вируса, в нашем случае – HbsAg, поступают в кровоток, по которому распространяются дальше.

Поскольку любой антиген (antigen) – это в буквальной расшифровке «производитель антител» (ANTIbody-GENerator), он способен сформировать иммунологический комплекс «антиген – антитело». Иными словами, он инициирует образование антител в организме человека, формируя специфический иммунитет, который сможет в будущем защитить человека от повторной атаки вируса. На этой важнейшей особенности HBV построен принцип производства большинства вакцин, содержащих в себе либо «мертвые» (инактивированные) HBsAg, либо генномодифицированные антигены, которые не способны привести к инфицированию, но наличия которых достаточно для формирования устойчивого иммунного ответа на вирус гепатита B.

Другие публикации:  Ишемически-гипоксическое поражение цнс синдром угнетения

Возбудитель гепатита В относится к гепаднавирусам (Hepadnaviridae), само название которых указывает на их отношение к печени (hepa) и к ДНК (DNA). Таким образом, HBV – это гепатотропный вирус, при этом единственный среди всех вирусов гепатита, содержащий ДНК. Его активность (контагиозность и вирулентность) зависит от многих факторов:

  • возраста (например, до 1 года – ≈90%, до 5 лет – ≈20–50%, старше 13 лет – ≈5%);
  • индивидуальной восприимчивости;
  • штамма вируса;
  • инфицирующей дозы;
  • гигиенических условий жизни и труда;
  • эпидемиологической обстановки.

Но в целом контагиозность вируса гепатита B невысокая, ниже средней, если только полностью не пренебрегать всеми правилами безопасной половой жизни и гигиены.

Но как же передается вирус гепатита B? Процесс инфицирования происходит посредством крови и биологических жидкостей следующими путями:

  1. Парентеральным, то есть при попадании напрямую в кровь или слизистую оболочку, минуя защитные барьеры организма, такие как кожный покров или желудочно-кишечный тракт. Примерами такого инфицирования может служить нестерильный шприц или любой хирургический инструмент.
  2. Вертикальным – трансплацентарным, то есть внутриутробно от матери к ребенку, во время родов, после них.
  3. Половым (во всех его формах).
  4. Бытовым, то есть через предметы личной гигиены (бритвы, расчески, зубные щетки), при нанесении татуировок, пирсинге и др.

Патогенез гепатита B

После того как произошло заражение, наступает инкубационный период, в течение которого вирус размножается и накапливается в организме «скрытно». В зависимости от многих факторов длительность скрытой фазы репликации вируса может серьезно разниться от случая к случаю, но в среднем это 55–65 дней.

По окончании инкубационного периода наступает так называемая продромальная фаза заболевания, предшествующая острому периоду и предвещающая его. Тогда проявляются первые признаки болезни в виде общего недомогания, слабости, усталости, лихорадки с температурой на грани 37°C, понижения аппетита, тошноты, нарушений стула, суставно-мышечных болей, чувства сдавленности и тяжести в правом подреберье, раздражительности и апатии, кожных высыпаний в области суставов и зуда. Здесь следует отметить, что все эти симптомы могут быть выражены в разной степени у различных людей, вовсе отсутствовать или оставаться незамеченными. Продромальный, или преджелтушный, период может длиться от 1 до 30 дней. О его окончании свидетельствуют увеличенная печень и селезенка (30–50% случаев), повышенный уробилиноген в моче, обесцвечивание кала, а в сыворотки крови можно обнаружить рост концентраций АлАт и АсАт, пониженное содержание лейкоцитов, хотя в целом лейкоцитарная формула в норме.

Желтушность кожного покрова и иктеричность склер (желтая пигментация белковой оболочки глаз) знаменуют вступление в острую фазу, или в период разгара гепатита B. Повышение содержания общего и прямого билирубина в сыворотке крови нарастает первую неделю-две желтушного периода заболевания, достигая своего максимума, после чего происходит стагнация и постепенный спад в пигментации кожи вплоть до полного исчезновения желтой окраски, на что может уйти до 180 дней и даже более.

В пиковых точках болезни в большинстве случаев фиксируют брадикардию, пониженное артериальное давление, ослабление сердечных тонов. Кроме того, если гепатит протекает в тяжелой форме, обнаруживаются:

  • угнетение центральной нервной системы;
  • выраженные нарушения в работе ЖКТ;
  • склонность к кровотечениям в слизистых оболочках (сильно понижен протромбиновый индекс);
  • концентрация АлАт выше АсАт;
  • пониженная сулемовая проба, реакция СОЭ – 2–4 мм/час, лейкопения;
  • лимфоцитоз.

После острого периода (не путать с тяжелой формой!) болезнь развивается по одному из следующих сценариев (см. рис. 1 и 2):

  1. наступает период реконвалесценции (выздоровления), с постепенным снижением (исчезновением) признаков гепатита B на клиническом, биохимическом и морфологическом уровнях;
  2. присоединяется суперинфекция в виде гепатита D и/или заболевание переходит в фульминантную форму, в так называемый молниеносный тяжелый гепатит (менее 1% случаев);
  3. болезнь переходит в активную хроническую форму:
    • a. выздоровление;
    • b. цирроз печени (20%), карцинома (1%);
  4. болезнь переходит в состояние устойчивой ремиссии (стабильная хроническая форма):
    • a. излечение;
    • b. внепеченочные патологии.

Рис. 1. Прогноз развития гепатита B

С точки зрения нагрузки на организм, врачи определяют три основных формы протекания острого гепатита B: легкая, средняя и тяжелая. С позиций выраженности симптомов заболевания, выделяют его желтушную (типичную), безжелтушную и субклиническую (атипичные) формы. В типичном варианте болезнь протекает в точности, как описано выше, однако это только 35% от всех случаев. Примерно 65% приходится на атипичные формы, когда не происходит пигментации кожных покровов и слизистой, а другие симптомы выражены слабо (безжелтушный вариант), или когда любые клинические проявления отсутствуют вовсе (субклиническая форма).

Как бы парадоксально это не звучало, но в большинстве случаев (до 90%) гепатит B не требует никакого специального лечения: достаточно поддерживающей терапии на основе гепатопротекторов – фосфатидилхолина, витаминов и микроэлементов, обильного питья и строгой диеты. Конечно, исключение составляют случаи с унаследованной инфекцией, или когда имеют место дефицит иммунитета (а также иммуносупрессивная терапия), сопутствующие болезни либо тяжелая форма заболевания. В остальном иммунитет человека самостоятельно «справляется» с вирусом в течение 1 или 2-х месяцев, приобретая специфический иммунитет. Многие люди, у которых обнаруживают антитела к вирусу, заявляют, что не болели им никогда, в то время как, на самом деле, они просто этого не заметили или спутали с обычным гриппом. Но так удачно складывается ситуация далеко не у всех инфицированных, кроме того, в какой бы форме человек не переболел гепатитом B, на протяжении всей жизни остается повышенный риск развития тех или иных патологий печени.

Рис. 2. Исход болезней при инфецировании HBV

Существует еще один интересный факт: так называемые бессимптомные носители антигена. Это не те люди, которые перенесли гепатит B в скрытой, субклинической форме – они вообще им не болели и не болеют! При этом носители HBsAg остаются опасными для окружающих. Как говорят врачи, такие люди выполняют роль «основного резервуара инфекции». Это явление не изучено, но вполне вероятно, что сам вирус оставляет данную категорию людей «нетронутой», чтобы сохранить свою популяцию «на черный день». По каким критериям вирус сохраняет здоровье именно этих людей, не принося никакого вреда их организму, – неизвестно. Но это всего лишь гипотеза, и в любом бессимптомном носителе вирус может «проснуться» в любую минуту, а может – никогда.

Диагностические критерии бессимптомного носительства следующие:

  • антиген HBsAg определяется в крови после 180 дней;
  • маркёр HBeAg (см. таблицу) в сыворотке не обнаруживается;
  • анти-HBe (см. таблицу) – присутствует;
  • уровень HBV ДНК в сыворотке крови менее 105 копий/мл;
  • концентрации АлАт/АсАт показывают норму при повторных анализах;
  • при биопсии печени гистологический индекс активности (МГА) воспалительно-некротического процесса в печени обычно ниже 4.

Маркеры гепатита В

Как можно увидеть, серологический маркер HBsAg является первым, основным, самым надежным, но далеко не единственным показателем инфекции гепатита B, кроме него требуют определения в сыворотке крови следующие антигены, антитела и молекулы ДНК вируса:

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему: Репликация HCV в патоморфогенезе хронического гепатита С (ультраструктурное, иммуногистохимическое и ПЦР-исследование)

Оглавление диссертации Караваева, Юлия Юрьевна :: 2006 :: Новосибирск

Глава I. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА С

1.1. Молекулярная биология вируса гепатита С

1.2. Методы идентификации вируса гепатита С

1.3. Современные концепции пато- и морфогенеза хронической HCV-инфекции.

Глава II. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИХ

НАБЛЮДЕНИЙ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Общая характеристика клинических наблюдений

2.2. Методы клинико-биохимического и серологического исследования.

2.3. Метод полимеразной цепной реакции.

2.4. Методы патоморфологического изучения биоптатов печени

2.5. Методы статистического анализа результатов.

Глава III. ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БИОПТАТОВ ПЕЧЕНИ ПАЦИЕНТОВ

С ХРОНИЧЕСКОЙ НСУ-ИНФЕКЦИЕЙ

3.1. Светооптическое исследование биоптатов печени.

3.2. Электронно-микроскопическое исследование.

3.3. Иммуногистохимическое исследование.

Глава IV. КЛИНИКО-БИОХИМИЧЕСКОЕ И СЕРОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ НСУ-ИНФЕКЦИЕЙ.

4.1. Клинико-биохимическое обследование пациентов.

4.2. Результаты серологического исследования.

Глава V. РЕПЛИКАЦИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА С

И СТЕПЕНЬ АКТИВНОСТИ ХРОНИЧЕСКОЙ НСУ-ИНФЕКЦИИ

5.1. Определение степени активности хронического гепатита С.

5.2. ПЦР-исследование репликации вируса гепатита С и сопоставление со степенью активности хронической HCV-инфекции

Введение диссертации по теме «Патологическая анатомия», Караваева, Юлия Юрьевна, автореферат

Актуальность темы. Вирус гепатита С (HCV), принадлежащий к семейству флавивирусов, — один из наиболее часто встречающихся инфекционных агентов, обусловливающих патологические изменения печени. Клинически поражение печени может варьировать от легкой формы хронического гепатита до цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы (Шерлок Ш., Дули Д., 1999; Ивашкин В.Т., 2002; Майер П., 2004; Ferreira-Gonzalez А., Shiftman M.L., 2004). В отличие от других гепатотропных вирусов человека, HCV в большинстве случаев вызывает хронический процесс с умеренным размножением вируса, что, как правило, характеризует HCV-инфек-цию как персистирующую (Толоконская Н.П., 1999; Непомнящих Г.И. и др., 2001; Pham T.N. et al., 2004).

Взаимодействие между вирусом гепатита С и иммунной системой инфицированного находится в фокусе активного изучения. HCV является РНК-вирусом с высоким уровнем генетической вариабельности, поэтому вирус может ускользать от иммунного ответа макроорганизма посредством продолжающихся мутаций (Colina R. et al., 1999; Kim Y.J. et al., 2005). Другой характеристикой HCV-инфекции является не только неадекватность гуморального и клеточного иммунного ответа, но и нередкое развитие аутоиммунного феномена (Ordi-Ros J. et al., 2000). Таким образом, пер-систенция HCV связана с развитием спектра иммунопатологических реакций, варьирующих от «безопасной» продукции органонеспецифических антител до лимфопролиферативных процессов, таких как смешанная кри-оглобулинемия II типа и неходжкинские лимфомы (Lauer G.M., Walker B.D., 2001).

HCV реплицируется не только в гепатоцитах, но и в мононуклеарных клетках периферической крови, клетках костного мозга и других органов, даже центральной нервной системы (Laskus Т. et al., 2000; Forton D.M. et al., 2004; Castillo I. et al., 2005; Goncalves P.L. et al., 2005). Лимфотропизм HCV указывает на прямое взаимодействие специфических протеинов вируса, в частности, core, с регуляторными механизмами и функциями лим-фоидных клеток (Schuttler C.G. et al., 2004; Tillmann H.L. et al., 2005). Результатом таких взаимодействий может быть модификация иммунного ответа против антигенов HCV и возникновение патологических реакций против аутоантигенов. Молекулярные процессы, лежащие в основе взаимодействия HCV и лимфоидных клеток, являются недостаточно изученными; предполагается, что в мононуклеарных клетках крови вирус индуцирует экспрессию Fas на поверхности клеток, что запускает процесс клеточной гибели путем апоптоза (Brown P.M.J., Neuman M.G., 2001). Получены также свидетельства того, что апоптоз инфицированных гепатоцитов опосредован экспрессией Fas (Pianko S. et al., 2001).

Другие публикации:  Понятия симптома синдрома фактора

Патогенез хронической HCV-инфекции остается недостаточно изученным. Рассматриваются два важнейших механизма в развитии инфекционного процесса: один из них — прямое цитопатическое действие вируса, другой представляет собой комплекс иммунных ответов, направленных против инфицированных гепатоцитов, содержащих чужеродные протеины HCV (Di Bisceglie A.M. et al., 1993; Kato N. et al., 1993). При попытке внести ясность в решение этой проблемы некоторые исследователи анализировали взаимоотношения между количеством вируса (виремии) в сыворотке крови или в ткани печени и характером ее патологических изменений (Idrovo V. et al., 1996; Chang M. et al., 2000; Benkoel L. et al., 2004).

Остается спорным вопрос, действительно ли виремия отражает количество вируса в печени, так как методы, используемые для количественного определения уровня РНК в печени, основаны на первичной экстракции из общей РНК гепатоцитов, количественное содержание вируса в гепато-цитах (точнее, число инфицированных гепатоцитов) — на чувствительности и специфичности метода. При использовании гибридизации in situ (Rodriguez-Inigo E. et al., 1999) установлено, что уровень виремии имеет отношение к числу инфицированных гепатоцитов у HCV-инфицированных пациентов с хроническим активным процессом — виремия коррелировала с процентом HCV-инфицированных гепатоцитов. Вероятно, оба варианта патогенеза хронической HCV-инфекции могут сосуществовать одновременно, и одним из возможных путей изучения является оценка корреляции между уровнем вирусной нагрузки и степенью повреждения печени (Haydon G.H. et al., 1998; Altiparmak E. et al., 2001).

Цель исследования — изучить роль репликации вируса гепатита С в патоморфогенезе хронической HCV-инфекции по данным клинико-биохимического, патоморфологического и ПЦР-исследования.

1. Изучить репликацию вируса гепатита С при хроническом гепатите С — наличие репликации в образцах крови и ткани печени, уровень виремии, генотип HCV.

2. Провести светооптическое, электронно-микроскопическое и им-муногистохимическое исследование биоптатов печени при хронической HCV-инфекции.

3. Сопоставить данные по репликации вируса гепатита С с результатами клинико-биохимического и патоморфологического исследования.

Научная новизна. Впервые проведено исследование маркеров репликации вируса гепатита С в различных биологических субстратах (по данным ПЦР с РНК HCV), количества инфицированных гепатоцитов (по данным иммунодетекции NS3-антигена HCV в биоптатах печени), уровня виремии и генотипа HCV в сопоставлении со степенью активности хронической HCV-инфекции.

Впервые показано, что наличие РНК вируса гепатита С в крови и/или ткани печени (по данным ПЦР) и число инфицированных гепатоцитов (по экспрессии NS3Ag при иммуногистохимическом исследовании) не имеют достоверной связи со степенью активности инфекционного процесса, оцениваемой по клинико-биохимическим тестам и структурным изменениям печени.

Установлено, что при достаточно высоком уровне виремии (от 10б до 108 копий HCV в 1 мл плазмы) доминировали минимальные изменения структуры печени: в 60% случаев выявлена слабо выраженная степень активности HCV-инфекции (r=0,631, р < 0,001).

Независимо от генотипа HCV доминировала слабо выраженная степень активности инфекционного процесса (в том числе при генотипе lb — в 70% случаев). Отсутствие зависимости между репликацией HCV и степенью поражения печени при хронической HCV-инфекции обусловлено выраженной антивирусной реакцией гепатоцитов, фенотипически проявляющейся клеточно-инволютивной дистрофией.

Практическая значимость. Полученные в работе данные могут быть использованы в клинической практике для решения вопросов диагностики, терапии и прогноза хронических вирусных гепатитов. Проведенное исследование свидетельствует о важности и необходимости патоморфологиче-ского изучения биоптатов печени. Отсутствие зависимости между репликацией HCV и степенью активности патологического процесса в печени требует критического пересмотра алгоритмов диагностики и лечения хронического гепатита С, ориентированных на результаты ПНР как на основной диагностический и прогностический фактор заболевания, и подчеркивает необходимость биопсии печени для адекватной диагностики и оценки динамики патологического процесса.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 12 — 14-й научно-практических конференциях врачей «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 2002 — 2004), на областной научно-практической конференции «Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине» (Новосибирск, 2002), на городских научно-практических конференциях «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2002, 2003), на VI Российском съезде врачей-инфекционистов (С-Пб., 2003), на 9-й Российской конференции «Гепатология сегодня» (М., 2004), на юбилейной научно-практической конференции «Инфекционные болезни на современном этапе: Достижения, проблемы, перспективы» (Новосибирск, 2004), на международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирск, 2004), на Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Новосибирск, 2005), на ученом совете ГУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2006).

Публикации. По теме кандидатской диссертации опубликованы 22 научные работы:

1. Караваева Ю.Ю., Шестенко О.П. Результаты ПЦР-исследований на вирусные гепатиты в различных биологических субстратах (опыт ПЦР-лаборатории МИКБ № 1) // Актуальные вопросы современной медицины: Тезисы докл. 12-й науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 2002. — С. 362.

2. Караваева Ю.Ю., Шестенко О.П. Опыт использования отечественных ПЦР-тест-систем в лабораторной практике // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике: Сборник статей городской науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2002. — Вып. 2. — С. 44 — 52.

3. Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Сахарова Е.Г., Мезенцева Г.А., Караваева Ю.Ю. Морфогенез хронического гепатита С: Патоморфологическое, молекулярно-биологиче-ское и иммуногистохимическое исследование биоптатов печени // Сиб. журн. гастроэнтерол. и гепатол. — 2002. — № 14 — 15. — С. 7 — 9.

4. Непомнящих Г.И., Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Толоконская Н.П., Караваева Ю.Ю. и др. Иммуногистохимическое, молекулярнобиологическое и патоморфологическое исследование биоптатов печени при хроническом гепатите С // Бюл. экспер. биол. — 2002. — Т. 134, № 9. -С. 356-360.

5. Nepomnyashchikh G.I., Aidagulova S.V., Nepomnyashchikh D.L., То-lokonskaya N.P., Karavaeva Yu.Yu. et al. Immunohistochemical, molecular and pathomorphological study of liver biopsy specimens during chronic hepatitis С // Bull. Exper. Biol. Med. — N. Y.: Plenum Publ. Corp., 2002. — Vol. 134, № 3. -P. 307-311.

6. Непомнящих Г.И., Айдагулова C.B., Караваева Ю.Ю. и др. Биомолекулярные маркеры хронической HCV-инфекции // Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине: Материалы областной науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2002. — С. 37 — 38.

7. Караваева Ю.Ю., Айдагулова С.В., Батемирова Е.В. Оценка реп-ликативной активности вируса гепатита С в различных биологических субстратах у больных хроническим вирусным гепатитом // Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине: Материалы областной науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2002. — С. 113-114.

8. Мезенцева Г.А., Айдагулова С.В., Караваева Ю.Ю., Батемирова Е.В. Морфологические маркеры токсического поражения печени у наркозависимых пациентов с хронической HCV-инфекцией // Бюл. СО РАМН. -2003.-№ 1.-С. 28-31.

9. Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Караваева Ю.Ю. и др. Является ли репликация вируса гепатита С маркером степени активности инфекционного процесса ? (по данным полимеразной цепной реакции и морфологического анализа биопсий печени) // Бюл. экспер. биол. — 2003. — Т. 135, № 3. — С. 343 — 348.

10. Nepomnyashchikh G.I., Tolokonskaya N.P., Aidagulova S.V., Nepomnyashchikh D.L., Karavaeva Yu.Yu. et al. Is replication of hepatitis С virus a marker of activity of infectious process? (Findings of polymerase chain reaction and morphological analysis of liver biopsy specimens) // Bull. Exper. Biol. Med. — N.-Y., 2003. — Vol. 135, N 3. — P. 296 — 300.

П.Гончарова И.А., Курышева Н.Г., Красильникова И.В., Караваева Ю.Ю. и др. Активность хитотриозидазы сыворотки крови у больных вирусным гепатитом С на фоне наркотической зависимости // Актуальные вопросы современной медицины: Тезисы докл. тринадцатой науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 2003. — С. 341.

12. Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., Караваева Ю.Ю. и др. Им-муногистохимическое, молекулярно-биологическое и патоморфологиче-ское исследование биоптатов печени при хроническом гепатите С // Актуальные вопросы современной медицины: Тезисы докл. тринадцатой науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 2003. — С. 351.

13. Караваева Ю.Ю., Шмакова М.В., Красильникова И.В. и др. Значение ПЦР в диагностике парентеральных гепатитов // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике: Сборник статей городской науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2003. — Вып. 4. — С. 174-181.

14. Караваева Ю.Ю., Непомнящих Г.И., Сахарова Е.Г. и др. Сопоставление уровня виремии, генотипа вируса и степени активности по биопсиям печени у больных с хронической HCV-инфекцией // Материалы VI Российского съезда врачей-инфекционистов. — С-Пб., 2003. — С. 163.

15. Непомнящих Г.И., Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Караваева Ю.Ю. Биопсия печени в диагностике и прогнозе хронической HCV- и HBV-инфекции // Рос. журн. гастроэнтерол. — Приложение № 22. Материалы 9-й Рос. конф. «Гепатология сегодня». — М., 2004. — С. 19, № 62.

16. Караваева Ю.Ю., Мельникова О.В. Значение методов ИФА и ПЦР в диагностике репликативной активности вируса при хронической HBV-инфекции // Тезисы докл. юбилейной науч.-практ. конф. врачей «Инфекционные болезни на современном этапе: Достижения, проблемы, перспективы». — Новосибирск, 2004. — С. 49 — 50.

17. Караваева Ю.Ю., Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П. и др. Им-муногистохимическое, молекулярно-биологическое и патоморфологиче-ское исследование биоптатов печени у больных хроническим гепатитом С // Тезисы докл. юбилейной науч.-практ. конф. врачей «Инфекционные болезни на современном этапе: Достижения, проблемы, перспективы». — Новосибирск, 2004. — С. 51 — 52.

18. Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Караваева Ю.Ю., Мезенцева Г.А. HCV-инфекция: Репликация вируса и активность инфекционного процесса // Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». — Новосибирск, 2004. — С. 173.

19. Томиленко Т.Г., Мельникова О.В., Караваева Ю.Ю. и др. Оценка значимости специфических маркеров в диагностике хронической HCV-инфекции // Актуальные вопросы современной медицины: Тезисы докл. четырнадцатой науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 2004. — С. XI-12.

20. Караваева Ю.Ю., Мельникова О.В. Оценка репликативной активности вируса при хронической HBV-инфекции методами ИФА и ПЦР // Генодиагностика инфекционных болезней: Материалы Российской науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2005. — С. 48 — 50.

21. Караваева Ю.Ю., Сахарова Е.Г., Красильникова И.В. и др. Диагностический мониторинг при проведении комбинированной противовирусной терапии хронического гепатита С // Генодиагностика инфекционных болезней: Материалы Российской науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2005. -С. 51-53.

Другие публикации:  Как вылечить простуду на губах за 2 дня

22. Пышный Д.В., Пышная.И.А., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М., Караваева Ю.Ю. и др. Генодиагностика вируса гепатита С методом обратной гибридизации // Генодиагностика инфекционных болезней: Материалы Российской науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2005. — С. 60 — 64.

Заключение диссертационного исследования на тему «Репликация HCV в патоморфогенезе хронического гепатита С (ультраструктурное, иммуногистохимическое и ПЦР-исследование)»

1. Наличие РНК вируса гепатита С в крови и/или ткани печени по данным полимеразной цепной реакции и число инфицированных гепатоцитов (по экспрессии NS3Ag при иммуногистохимическом исследовании) не имеют достоверной связи со степенью активности инфекционного процесса, оцениваемой по клинико-биохимическим тестам и патоморфологи-ческому исследованию биоптатов печени.

2. При сравнительно высоком уровне виремии (от 10 до 10 копий HCV в 1 мл плазмы крови — предел тест-системы) доминируют минимальные изменения структуры печени: в 60% случаев выявлена слабо выраженная степень активности HCV-инфекции (r=0,631, р < 0,001).

3. При позитивной иммунодетекции NS3Ag HCV в биоптатах печени установлена слабо выраженная (53% случаев) и минимальная (18% случаев) степень активности хронического гепатита С при различном количестве экспрессирующих NS3Ag гепатоцитов. Количество инфицированных гепатоцитов не коррелировало со степенью активности инфекционно-вирусного процесса.

4. При генотипировании HCV в 53% случаев выявлен генотип lb, в 30% случаев — генотип 2, в 14% — генотип За. Сопоставление генотипа HCV с уровнем виремии и степенью активности инфекционного процесса не выявило корреляционной связи. При генотипе lb в 80% случаев установлена слабо выраженная (70% случаев) и минимальная (10% случаев) степень активности инфекционного процесса.

5. При тестировании пяти биологических субстратов РНК HCV выявлена преимущественно в ткани печени — 79% случаев, в сыворотке крови -77% и мононуклеарных клетках крови — 73%; одновременно и в сыворотке, и в мононуклеарах — в 55% наблюдений, при этом в 18% случаев РНК HCV обнаружена в клеточных элементах и отсутствовала в сыворотке крови. РНК HCV выявлена в образцах слюны у 7 человек, в моче — у 5, у 3 пациентов — в обоих субстратах.

6. Наличие РНК HCV в нативной ткани печени сопровождалось им-муногистохимическим выявлением NS3-aHrareHa, т.е. иммунодетекция NS3 в гепатоцитах может рассматриваться как структурный маркер репликации вируса гепатита С. В большинстве случаев выявление антител к NS3 в сыворотке крови сочеталось с экспрессией NS3-aHrareHa в гепатоцитах. Интенсивная (выраженная и умеренная) иммуногистохимическая реакция с NS3-aHTHreHOM HCV в биоптатах печени в большинстве случаев сочеталась с нормальными показателями аминотрансфераз.

7. Анализ сопоставления серологических маркеров репликации вируса гепатита С по данным ПЦР и степени активности инфекционно-вирусного процесса по биоптатам печени показал, что при наличии РНК HCV в сыворотке и/или мононуклеарных клетках крови в 71% случаев в биоптатах обнаружена минимальная (16%) и слабо выраженная (55%) степень активности процесса. При отрицательной реакции на РНК HCV также преобладали минимальные патологические изменения в ткани печени. Статистический анализ не выявил корреляционной связи между наличием репликации вируса в крови и проявлениями структурных изменений в ткани печени.

8. Отсутствие зависимости между репликацией HCV и степенью поражения печени при хронической HCV-инфекции обусловлено выраженной антивирусной реакцией гепатоцитов, фенотипически проявляющейся клеточно-инволютивной дистрофией.

Инфицирование вирусом гепатита С (HCV) считается одной из ведущих причин заболеваемости и смертности во всем мире, вызывая широкий спектр поражений печени от бессимптомного носительства до терминальной стадии заболевания (Ивашкин В.Т., Буеверов А.О., 2002; Никитин И.Г., 2002). Наиболее важными особенностями HCV являются высокий уровень репликации, широкое генетическое разнообразие и изменчивость, которые обеспечивают уклонение от иммунного контроля, высокий процент хронизацин HCV-инфекции и распространенность феномена перси-стенции вируса. Встречаемость иммунологических маркеров HCV-инфекции у различных групп населения в разных странах колеблется от 1 до 10% (Львов Д.К., Дерябин П.Г., 1997). В США антитела к HCV обнаружены у 1,8% населения, у 75% из них выявлена виремия, и 2,7 миллионов человек имеют признаки активной HCV-инфекции (Lauer G.M., Walker B.D., 2001).

В Российской Федерации частота обнаружения антител к антигенам HCV в сыворотке крови доноров составляет 2 — 4% (Львов Д.К. и др., 1997). В настоящее время интенсивно изучаются свойства вируса гепатита С и особенности реакций организма инфицированного, создающие несостоятельность иммунного ответа и способствующие персистенции вируса и хронизации процесса (Bertoletti A., Maini М.К., 2000).

Нами было обращено внимание на то, что минимальная и слабо выраженная степень активности HCV-инфекции, определяемая по клиническим, биохимическим и патоморфологическим тестам, нередко сочетается с фазой репликации HCV. В связи с этим мы поставили своей задачей найти объяснение этому феномену путем тщательного анализа клинических, биохимических и патоморфологических данных и их сопоставления с ПЦР-исследованием.

Итак, при патоморфологическом исследовании биоптатов печени пациентов с хронической HCV-инфекцией обнаружены следующие закономерности. Для паренхиматозного компартмента характерны поражения дистрофического характера. Наиболее часто обнаруживали гепатоциты в состоянии жировой инфильтрации разной степени выраженности: от мелковезикулярных липидных включений, выявляемых лишь на полутонких срезах, до замещения всей цитоплазмы огромной липидной каплей, вызывающей деформацию и дислокацию ядра. Отмечено, что для гепатита С характерны мелковезикулярные липидные включения, располагающиеся преимущественно субплазмолеммально.

Вторым по частоте патологическим феноменом, характеризующим состояние паренхиматозных клеток, была клеточно-инволютивная дистрофия. Эти гепатоциты светооптически отличались своеобразным «опустошением» цитоплазмы, резким снижением содержания гликогена и гипо-хромностью ядер, располагались группами, иногда образуя округлые поля, занимающие территорию нескольких долек, или большинства фрагментов долек биоптата. В единичных случаях в биоптатах выявляли паренхиматозные клетки с признаками ацидофильной дегенерации, гомогенной резко эозинофильной цитоплазмой и пикнотичными ядрами. Как правило, эти гепатоциты локализовались перипортально.

Ультраструктурный анализ гепатоцитов выявил их значительную гетерогенность. Доминировали клетки с признаками клеточно-инволютив-ной дистрофии — феномен «опустошенности» связан с редукцией цито-плазматических органелл. Выявлялась динамика дистрофического процесса от фокальной редукции внутриклеточных органелл до почти тотальной «опустошенности». Процесс дегенерации сопровождается формированием гетерогенных резидуальных телец, иногда очень многочисленных, локализующихся в различных участках цитоплазмы, нередко мигрирующих к васкулярному полюсу гепатоцита и обнаруживаемых в пространстве Диссе. В гепатоцитах с «опустошенной» цитоплазмой сохранялось ядро и пе-ринуклеарные скопления элементов гранулярной цитоплазматической сети, свободных рибосом, полисом и мелких митохондрий.

В большинстве биоптатов наблюдали заметное расширение и деформацию портальных трактов за счет клеточной инфильтрации и склероза, обычно с сохранением четких паренхиматозно-стромальных границ. Состав инфильтрата представлен лимфоцитами, макрофагами, а также фиб-робластами различной степени зрелости, количественное соотношение которых определяется преобладанием фиброза или инфильтрации в портальном тракте.

Также в большинстве биоптатов обнаружена гиперплазия лимфоид-ной ткани портальной стромы в виде формирования округлых фолликуло-подобных образований, в некоторых образцах выявлены крупные лимфо-идные фолликулы с герминативными центрами — один из ведущих морфологических маркеров HCV-инфекции, а также признаки лимфодиапедеза, в результате которого появлялись внутрисинусоидальные и интергепатоцел-люлярные цепочки лимфоцитов и внутридольковые лимфоидные инфильтраты. Некробиотические очаги в паренхиме обнаруживали крайне редко, лишь при высокой степени активности HCV-инфекции, иногда выявляли внутридольковые постнекротические гранулемы.

Фиброзные изменения касались прежде всего портальной стромы. Однако в половине случаев (преимущественно у наркозависимых пациентов) наблюдали формирование прогностически неблагоприятного очагового или диффузного перисинусоидального склероза, а также склероз центральных вен с перивенулярным фиброзом. В большинстве случаев фиброзные изменения при хроническом гепатите С выражены слабо.

При вирусных поражениях печени ведущую роль в морфо- и цитоге-незе инфекционного процесса играет отношение субпопуляций альтерированных и регенерирующих гепатоцитов (Непомнящих Д.Л., 1994, 1998). Кроме описанных ранее структурных изменений печени (Серов В.В., Се-вергина Л.О., 1996; Непомнящих Г.И. и др., 1999; Серов В.В., 1999), показано, что при хроническом гепатите С преобладает особая форма повреждения гепатоцитов, характеризующаяся редукцией цитоплазматических органелл и визуальной картиной «опустошенности» клеток, что и подтверждено в данном исследовании.

Основу данной формы дистрофии составляет не альтерация и последующий некроз гепатоцитов, а снижение процессов восстановления «изношенных» цитоплазматических органелл за счет угнетения синтеза структурных белков — синдром регенераторно-пластической недостаточности (Непомнящих Г.И. и др., 1992). Этот вид дистрофии гепатоцитов имеет инволютивный морфологический фенотип, но, учитывая сохранение ядера и очагов внутриклеточной регенерации, можно считать это состояние клетки обратимым. Это можно интерпретировать и как защитную реакцию клетки в условиях вирусной инфекции.

По результатам комплексного исследования хронического гепатита С Г.И. Непомнящих и соавт. (1999, 2002) сформулирована концепция антивирусной стратегии популяции паренхиматозных клеток печени, включающая снижение биосинтетических реакций гепатоцита и в связи с этим подавление репликации вируса, а также фокальную деградацию цитоплаз-матического компартмента и экзоцитоз с элиминацией вирусных частиц (цитосанация) с последующим восстановлением структуры гепатоцитов за счет внутриклеточной регенерации. Распространенность такого вида клеточных изменений свидетельствует о важной роли клеточно-инволютив-ной дистрофии в морфогенезе и прогнозе болезни.

При сопоставлении данных ПЦР по определению РНК HCV и степени активности процесса по биопсиям печени при хронической HCV-инфекции обнаружено, что наличие репликации вируса не имеет достоверной связи со степенью активности инфекционного процесса. В основе этого феномена лежит главным образом выраженная антивирусная реакция паренхиматозных клеток печени, нивелирующая способность HCV к интенсивной репликации, гетерогенности и изменчивости, которые обусловливают несостоятельность иммунного ответа.