Лабораторное исследование туберкулеза

Лабораторное исследование туберкулеза

2 . Методы диагностики туберкулеза.

2.4. Лабораторные методы выявления микобактерий туберкулеза.

В будущем не трудно будет решить, что это — туберкулез или нет … Демонстрация туберкулезной бациллы… решит вопрос

Лабораторная диагностика обеспечивает выполнение главной задачи диагностики и лечения туберкулеза – выявление у больного МБТ. В лабораторную диагностику на современном этапе входят следующие методики:
1. сбор и обработка мокроты;
2. микроскопическая идентификация МБТ в выделяемых субстанциях или тканях;
3. культивирование;
4. определение резистентности к препаратам;
5. серологические исследования;
6. выполнение новых молекулярно-биологических методов, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Сбор мокроты, содержащую МБТ, проводится в специально подготовленном помещении больницы или в амбулаторных условиях. Собранные образцы должны быть немедленно отосланы в соответствующую лабораторию.

Для этого должны использоваться специальные контейнеры. Контейнеры должны быть прочными, устойчивыми к разрушению, иметь широкую горловину с герметически завинчивающейся пробкой, чтобы предотвратить случайное вытекание из нее содержимого.

Имеются два удобных для этого типа контейнеров. Один – распространяемый международной организацией UNICEF (ДЕТСКИЙ ФОНД ООН), является пластмассовой пробиркой с черным основанием, прозрачной крышкой, утилизация которого может быть обеспечена сжиганием. На контейнере (не на крышке) отмечаются данные обследуемого. Другой тип контейнера – сделан из прочного стекла, с завинчивающейся крышкой. Такой контейнер может многократно использоваться после дезинфекции, кипячением (10 мин.) и c полной очисткой.

При сборе образцов риск инфекции очень большой, особенно когда больной выкашливает мокроту, в связи с этим процедуру необходимо проводить как можно дальше от посторонних лиц и в специальном помещении.

Дополнительные процедуры для сбора МБТ.

Забор образцов из гортани тампоном. У пациентов, не имеющих мокроту, для получения материала для посева МБТ можно использовать тампоны на палочке. Оператор должен носить маску и закрытый халат: язык пациента вытягивается изо рта, одновременно тампон вводится, за языковое пространство ближе к гортани. Во время кашля пациента можно собрать часть слизи. Тампон помещается в закрытый сосуд и направляется в бактериологическую лабораторию.

Промывные воды бронхов. Для своевременной диагностики туберкулеза легких и и трахеобронхиальной системы большое значение имеет раннее распознавание поражения бронхов. Для этой цели в практике применяется исследование промывных вод бронхов. Методика получения промывных вод не сложна, но надо помнить о противопоказаниях ее применения. Людям старческого возраста промывание бронхов следует делать, с большой осторожностью. Процедура противопоказана при заболеваниях бронхиальной астмой, а также при явлениях сердечно-легочной недостаточности.

Для получения промывных вод бронхов больному анестезируют дыхательные пути. Гортанным шприцем вводят 15—20 мл физиологического раствора, подогретого до 37°. Это усиливает секрецию слизистой бронхов. Откашливая, больной выделяет промывные воды. Их собирают в стерильную посуду и обрабатывают обычным способом для бактериоскопии и посева на средах для выращивания БК. Производится исследование отдельного бронха или целого ветвления. Метод бактериоскопии промывных вод, и особенно их посев, увеличил число находок БК на 11—20%.

Промывные воды желудка. Промывные воды желудка нередко исследуются у детей, которые не умеют откашлять мокроту, а также у взрослых при скудном количестве мокроты. Метод не труден и дает довольно большой процент обнаружения БК в промывных водах желудка или бронхов у больных не только легочным туберкулезом, но и туберкулезом других органов (кожи, костей и суставов и др.).
Для получения промывных вод больной, утром натощак должен выпить стакан кипяченой воды. Затем желудочным зондом собирают воды желудка в стерильную посуду. После этого воды центрифугируют, мазок делают из гнойных элементов полученного осадка, обрабатывают и красят обычным способом, как мокроту.

Исследование спинномозговой жидкости. При подозрении на туберкулезный менингит необходимо в первые дни сделать анализ спинномозговой жидкости. При взятии спинно­мозговой жидкости обращается внимание на степень давления, под которым она вытекает из спиномозгового канала. Жидкость, вытекающая непрерывной струей под большим давлением, свидетельствует о повышенном внутричерепном давлении. Жидкость, выделяющаяся крупными частыми каплями, говорит о нормальном давлении, а редкими малыми каплями — о пониженном давлении или о препятствии для истечения ее.

Материал для исследования берут в две стерильные пробирки. Одну оставляют на холоде и через 12—24 часа, в ней образуется нежная паутинообразная пленка. Из другой пробирки берут ликвор для биохимических исследований и изучения цитограммы.

Бронхоскопия. Когда другие методы не сумели обеспечить постановку диагноза, применятся сбор материала непосредственно из бронхов, через бронхоскоп. Биопсия выстилающих бронхи тканей может иногда содержать типичные для туберкулеза изменения, с последующим гистологическим исследованием.

Плевральная жидкость. В плевральной жидкости МБТ могут быть выявлены с помощью флотации, но обычно обнаруживаются только в культуре. Чем большее количество жидкости используется для культурального исследования, тем вероятней положительный результат.

Биопсия плевры. Биопсия плевры может быть полезна, в тех случаях, когда имеется ее поражение. При этом необходима специальная биопсийная игла, средства для проведения гистологического исследования и обученный персонал

Биопсия легкого. Биопсия легкого должна выполняться хирургом, в стационарных условиях. Диагноз может быть сделан на основе гистологического исследования или обнаружения МБТ в секционном материале.

Микроскопия мокроты .

Уже более 100 лет существует самый простой и быстрый метод выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУБ) — это микроскопия мазка. КУБ – микобактерии способные оставаться окрашенными даже после обработки кислотными растворами и могут быть выявлены с помощью микроскопа в окрашенных образцах мокроты. Микобактерии отличаются от других микроорганизмов характерным составом своей клеточной стенки, состоящей из миколовых кислот, которые, благодаря своим сорбционным свойствам, обеспечивают способность окрашиваться по методикам, выявляющим КУБ.

Резистентность к стандартным методам окрашивания и способность МБТ сохранять раннее окрашивание, является следствием высокого содержания липидов во внешней оболочке клетки. Вообще, грамм-положительные бактерии, в своем составе, имеют приблизительно 5 % липидов или воска, грамм-отрицательные организмы около — 20 % и МБТ примерно 60 %.

Бактериоскопия мокроты или другого отделяемого проводится «простым» методом и методом флотации.

При простом методе мазки приготавливают из

комочков мокроты или капель жидкого вещества (экссудата, промывных вод и др.). Материал помещают между двумя предметными стеклами. Один из мазков окрашивают по Грамму на общую флору, другой — на туберкулезные микобактерии.

Метод, который до сих пор используются это карбол-фуксиновый (метод Циля-Нильсена). Основной принцип этого метода состоит в способности наружной оболочки МБТ адсорбировать карбол-фукцин. Поглощая красный карбол-фуксин, наружная мембрана МТБ настолько прочно абсорбирует краску, что ее нельзя удалить обработкой серной кислотой или соляно кислым спиртом. Затем образец обрабатывается метиленовым синим. При эмерсионной микроскопии МБТ появляются в виде красных палочек на синем фоне.

Начиная с 1989 в современных лабораториях флюоресцентная микроскопия в значительной степени вытеснила старые методы, основанные на кислотоустойчивости микобактерий. Этот метод основан на тех же свойствах МБТ, связанные со способностью наружной мембраны МБТ, богатой липидами, удерживать соответствующий краситель в этом случае – аурамин-родамин. МБТ поглощая это вещество, одновременно устойчива обесцвечиванию соляно-кислым спиртом. При этом, МБТ, окрашенные аурамин-родамином, флюоресцируют под воздействием ультрафиолета или другими световыми спектрами света, выделенными соответствующими фльтрами. При этом МБТ проявляются как ярко-желтые палочки на черном фоне.

Подготовка образца для культурального исследования.

При поступлении в современную лабораторию диагностического материала, с возможным содержанием МБТ, проводятся следующие диагностические манипуляции.
1. Обработка материала миколитическими разжижающими веществами, с целью удаления белковых масс.
2. Деконтаминация образца, с целью удаления сопутствующей бактериальной флоры.
3. Встряхивание смеси и ее отстаивание.
4. Холодное центрфугирование.
5. Содержимое центрифужной пробирки используется для микроскопии, посева на:
5.1. плотную яичную среду (Левенштейна-Йенсена или Финна III );
5.2. агаровые среды (7Н10 и 7Н11);
5.3. на атоматизированную систему бульонного культивирования ( MB / BacT или BACTEC MGIT 960).

Молекулярно-генетические методы диагностики МБТ.

Расшифровка генома МБТ открыла неограниченные перспективы, в разработке генетико-молекулярных тестов, в том числе в изучении и выявлении МБТ и ее диагностике в организме человека.

Классические методы, применяемые для обнаружения наличия в организме микобактерий туберкулеза, такие как бактериоскопия, культуральный, иммуноферментный, цитологический весьма эффективны, но отличаются или недостаточной чувствительностью, или длительностью выявления МВТ. Развитие и совершенствование молекулярно-диагностических методов открыло новые перспективы для быстрого выявления микобактерий в клинических образцах.

Наибольшее распространение получили метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Метод полимеразной цепной реакции основан на амплификации особых фрагментов бацилярной ДНК, которая обнаруживается в диагностических образцах . Тест предназначен для выявления МБТ в мокроте или для идентификации разновидности бактерий, которые произрастают в культуральной среде.

Реакция ПЦР позволяет проводить идентификацию МВТ в диагностическом материале за 5-6 часов (включая обработку материала) и обладает высокой специфичностью и чувствительностью (в диапазоне от 1-10 клеток в образце).

Лабораторная диагностика туберкулеза

лабораторная диагностика занимает ведущее место в выявлении многих инфекционных заболеваний.

Диагностика туберкулеза основывается на данных клинических, гистологических, микробиологических исследований, оценке результатов туберкулиновых проб и тест-терапии. Из этих методов самым надежным является обнаружение микобактерий туберкулеза (МБТ), остальные же информативны только в комплексе. Современная микробиологическая диагностика туберкулеза состоит из нескольких основных групп анализов, направленных на:

• выявление (обнаружение) возбудителя;
• определение лекарственной устойчивости;
• типирование микобактерий туберкулеза.

Бактериоскопические методы. Обнаружение возбудителя начинается с наиболее простых и быстрых бактериоскопических методов: световой микроскопии с окраской по Цилю–Нильсену и люминесцентной микроскопии с окраской флюорохромами. Преимущество бактериоскопии – в быстроте получения результата, однако возможности ее ограничены из-за низкой чувствительности. Этот метод является наиболее экономичным и рекомендован Всемирной организацией здравоохранения в качестве основного для выявления заразных больных.

Культуральные исследования. «Золотым стандартом» выявления МБТ признаны культуральные исследования. В России для посева патологического материала используют яичные среды: Левенштейна–Йенсена, Финна-II, Мордовского и др. Для повышения процента выделения микобактерий посевы патологического материала проводят на несколько сред, в том числе и на жидкие, что позволяет удовлетворить все культуральные потребности возбудителя. Посевы инкубируют
до 2,5 месяцев, при отсутствии роста к этому времени посев считается отрицательным.

Метод биологической пробы. Наиболее чувствительным способом обнаружения МБТ считается метод биологической пробы – заражение диагностическим материалом высокочувствительных к туберкулезу морских свинок.

Молекулярно-генетическая диагностика. Развитие молекулярной биологии позволило значительно повысить эффективность обнаружения микобактерий. Базовым методом молекулярно-генетических исследований является полимеразная цепная реакция (ПЦР), направленная на выявление ДНК микобактерий в диагностическом материале. ПЦР дает экспоненциальную амплификацию специфического участка ДНК возбудителя: 20 циклов ПЦР приводят к увеличению содержания исходной ДНК в 1 миллион раз, что позволяет визуализировать результаты методом электрофореза в агарозном геле. Роль молекулярной диагностики в клинической практике повышается, поскольку увеличивается число больных со скудным бактериовыделением. Однако при установлении диагноза результаты ПЦР являются дополнительными и должны сопоставляться с данными клинического обследования, рентгенографии, микроскопии мазка, посева и даже ответа на специфическое лечение.

Туберкулинодиагностика. Косвенные методы для определения наличия МБТ в организме больного базируются в основном на выявлении специфических антител. Исторически первым методом является туберкулинодиагностика – она заключается в выявлении иммунных реакций, развивающихся в коже при введении туберкулина. Из большого количества вариантов туберкулиновых проб в настоящее время широко используется внутрикожная проба Манту. Методы туберкулинодиагностики сохранили свое диагностическое значение только среди пациентов детского и подросткового возраста.

Вспомогательную роль в диагностике внелегочного туберкулеза играют пробы с подкожным введением туберкулина, когда ориентируются на характерную очаговую реакцию (туберкулез глаз, туберкулез женских половых органов). Более широкому применению туберкулиновых проб с диагностической целью у взрослых препятствует невозможность в большинстве случаев отличить состояние инфицированности и болезни.

Иммуноферментный анализ. Существуют методики для определения антител к МБТ в различных биологических субстратах с помощью иммуноферментного анализа. Главная проблема, возникающая при разработке специфической иммунодиагностики, заключается в получении препаратов антигенов и антител, позволяющих добиться оптимального соотношения чувствительности и специфичности тестов. Сейчас преобладает мнение о целесообразности использования этих методов только для скрининга туберкулеза и отбора пациентов для детального обследования.

Диагностики ex juvantibus (тест-терапия). В случаях, когда указанные методы не позволяют подтвердить активный туберкулез (легких), можно использовать метод диагностики ex juvantibus. Больным с клиническими симптомами и рентгенологическими изменениями, которые свидетельствуют об активном туберкулезе или сомнительной активности процесса, а также при гиперергической туберкулиновой пробе назначают химиотерапию противотуберкулезными препаратами. В таких случаях через 2 – 3 месяца необходимо повторное рентгенологическое исследование. При заболевании туберкулезной этиологии отмечается частичное или полное рассасывание воспалительных изменений (это так называемый отсроченный диагноз).

Тест CLINISPOT-TB. Новый лабораторный тест для диагностики туберкулеза CLINISPOT-TB заключается в определении количества Т-лимфоцитов, высвобождающих -интерферон при контакте со специфическими антигенами МБТ. Наличие эффекторных Т-лимфоцитов свидетельствует об инфицировании МБТ. CLINISPOT-TB обладает высокой чувствительностью, позволяя выявлять единичные Т-лимфоциты и таким образом диагностировать латентную инфекцию, а также инфекцию у лиц со сниженным иммунным ответом. Высокая специфичность теста достигается использованием антигенов, специфичных для патогенных штаммов MБТ, что приводит к отсутствию ложноположительных результатов у вакцинированных или инфицированных другими микобактериями лиц. В ходе клинических исследований было показано, что чувствительность теста CLINISPOT-TB при активном туберкулезе достигает 96% даже у пациентов с внелегочной локализацией процесса, в то время как чувствительность кожной пробы составляла 69%.

Метод абсолютных концентраций. По приказу Минздравсоцразвития России № 109 от 21 марта 2003 г. в бактериологических лабораториях используется метод абсолютных концентраций: посев выделенных культур микобактерий на плотную питательную среду с критическими концентрациями противотуберкулезных препаратов. В случае выявления устойчивости к препаратам первого ряда (рифампицину, изониазиду, пиразинамиду, стрептомицину и этамбутолу) проводят исследование на устойчивость к препаратам резервного ряда (фторхинолонам, амикацину,капреомицину, циклосерину, парааминосалициловой кислоте, этионамиду, протионамиду).

Посев на жидкие питательные среды в системе BACTEC MGIT 960. В крупных противотуберкулезных центрах используют методы определения лекарственной устойчивости МБТ при посеве на жидкие питательные среды в системе BACTEC MGIT 960. Эта система проводит автоматизированный учет роста микобактерий, позволяя сокращать срок анализа до 14 дней.

Разрабатываются и внедряются новые методы оценки лекарственной устойчивости по мутациям в геноме МБТ и на основе микрочиповой технологии. Работа по изучению молекулярных механизмов резистентности показала наличие у микобактерий генов, мутации в которых определяют развитие устойчивости к различным препаратам: к изониазиду – гены katG, inhA, ahpC/oxyR, kasA, furA и ndh, к рифампицину – rpoB, к стрептомицину – rpsL, к фторхинолонам – gyrA и т.д. Большие надежды в области определения лекарственной устойчивости микобактерий связаны с развитием микрочиповой технологии. Этот высокочувствительный метод позволяет определять устойчивость микобактерий одновременно к нескольким противотуберкулезным препаратам непосредственно в диагностическом материале в течение 2 дней.

Комплекс методов имеется и для типирования микобактерий, в котором используются культуральные, биохимические, биологические, а также молекулярно-генетические методы. На основе молекулярно-генетического типирования микобактерий интенсивно развивается область молекулярно-эпидемиологических исследований, в которой по генотипу микобактерии выявляются очаги и прослеживаются пути распространения туберкулезной инфекции.

Лабораторная диагностика туберкулеза

Транскрипт

1 «Чахотка, изнурительная, смертельная болезнь, обычно с порчею легких». Толковый словарь живого великорусского языка В.Даля Лабораторная диагностика туберкулеза 1. Бактериоскопическое исследование 2. Бактериологическое исследование 3. Биологическая проба 1. Лабораторная диагностика туберкулеза используется для установления специфической этиологии заболевания, подозрительного на туберкулез. Производят микробиологическое исследование материала от больных: — мокроты; — спинномозговой жидкости,; — плевральной жидкости; — гноя; — мочи, кала; — пунктатов лимфатических узлов. Исследование на возбудителя туберкулеза производят непосредственно в доставленном материале бактериоскопическими, а кроме того, бактериологическими, биологическими методами. При необходимости исследовать свежую мокроту делают мазки препарата на предметных стеклах, высушивают на воздухе, фиксируют на пламени горелки. Затем препарат окрашивают карболовым фуксином, промывают водой и обесцвечивают 15 25%-ным раствором серной кислоты, промывают и докрашивают водным раствором метиленового спирта. После подсыхания препарат подвергают иммерсионной микроскопии, просматривают 100 полей зрения (практически весь препарат). Туберкулезные микобактерии визуализируются как ярко-красные, тонкие, изящные, в одиночку или группами, большей частью лежащие вне клеток палочки. В настоящее время имеет распространение метод флотации с последующей микроскопией. Промывные воды желудка бактериоскопически, дальнейшее исследование проводят так же, как и при исследовании мокроты. Мазок из гортани или зева окрашивают по Цилю-Нильсену. Мочу центрифугируют и готовят мазок из осадка мочи. Спинномозговую жидкость, взятую асептично, отстаивают сутки на холоде, после чего образуется тонкая фибринозная пленка (паутинка), в которой содержатся туберкулезные микобактерии. Делают мазок на предметном стекле,

2 высушивают на воздухе, фиксируют, окрашивают по Цилю- Нильсену. Если пленочка не образовалась, то исследованию подвергают отцентрифугированный осадок. Для обнаружения туберкулезных микобактерии применяется люминесцентная микроскопия, которая имеет ряд преимуществ перед прямой бактериоскопией в окрашенных препаратах. При люминесцентной микроскопии туберкулезные микобактерии светятся обычно золотисто-оранжевым светом на черном фоне (картина «звездного неба»); кислотоупорные сапрофиты зеленоватым с апельсиновым оттенком. При исследовании спинномозговой жидкости методом люминесцентной микроскопии положительные результаты можно получить в 12,5 раза чаще, чем при просмотре препаратов, окрашенных по Цилю-Нильсону. 2. Бактериологическое исследование. Методика бактериологического обнаружения туберкулезных микобактерии основана на их способности противостоять воздействию кислот и щелочей. Микобактерия туберкулеза после такой обработки остается вполне жизнеспособной, что позволяет еще до посева материала избавиться от находящихся в нем посторонних микробов. Микобактерии туберкулеза характеризуются некоторыми основными свойствами, используемыми для их дифференцирования. Они неподвижны, растут только в животном организме или на питательных средах специального состава (обычно с глицерином и яичным желтком); на обычных питательных (МПА) средах не растут. Оптимальная температура, при которой растут туберкулезные бактерии, равна 37 С, хотя возможен рост в пределах от 30 до 42 С. Для размножения микробов требуется длительное время: на искусственных питательных средах рост появляется только через дней. Колонии микобактерий туберкулеза имеют своеобразный вид, отличающийся шероховатостью (в виде плоских чешуек с возвышенным центром или розеток с углублением в центре), или же они могут быть гладкими блестящими, похожими на капли. На жидких питательных средах образуется толстая морщинистая пленка. Обычно для посева наследуемого материала пользуются средами Левенштейна Иенсена или Петраньяни. Посев выдерживают в термостате при температуре 37 С в течение 3 мес, проверяя наличие роста каждую неделю. Наиболее часто рост наблюдается в сроки от 3 до 6 недель. Штаммы, выделенные от больных, леченных химиопрепаратами, вырастают в гораздо более поздние сроки (через

3 дней). В настоящее время предложены и испытаны ускоренные методы выращивания культур туберкулезных микробов на препаратах — мазках (по Прайсу) и на кровяной среде. 3. Биологическая проба является по праву наиболее рациональным диагностическим приемом. Материал может быть введен под кожу или в полость живота морским свинкам. При наличии в материале вирулентных туберкулезных микобактерий обычно на й день в месте его введения под кожей образуется уплотнение, переходящее в дальнейшем в незаживающую язву. Свинки погибают от генерализованного туберкулеза через 2 4 мес. Ускоренная биологическая проба: через регионарный лимфатический узел морской свинки вводят несколько капель наследуемого материала. На 8 10-й день увеличенный лимфатический узел вырезают и исследуют бактериоскопически в препаратах-отпечатках на присутствие туберкулезных микобактерий. Диагностика туберкулеза органов дыхания в клинике внутренних болезней Диагностика туберкулеза традиционно включает три этапа: выявление больных, подтверждение диагноза и, в сомнительных случаях, проведение дифференциальной диагностики. Результат лечения, как правило, напрямую зависит от своевременности установления диагноза. Значительное увеличение заболеваемости туберкулезом в нашей стране за последнее десятилетие после длительного периода относительного благополучия привело к учащению случаев, когда диагноз туберкулеза устанавливается непоправимо поздно. Выявление больных туберкулезом Флюорография Многие годы для выявления новых случаев туберкулеза у взрослых в нашей стране использовали флюорографию органов грудной клетки. Исследованию ежегодно подвергали всех обратившихся в поликлиники; лиц, входящих в группу повышенного риска заболевания туберкулезом (больных сахарным диабетом, пациентов, длительно получающих глюкокортикостероиды и цитостатики, лучевую терапию и др.); так называемый декретированный контингент работников детских и медицинских учреждений, предприятий общественного питания, транспорта, продовольственных магазинов и др.). В случаях выявления изменений на флюорограмме пациентов направляли на дообследование в противотуберкулезное учреждение. Такой подход, как правило, обеспечивал своевременное выявление больных с ограниченными поражениями легких в виде очагов, небольших

4 инфильтратов и туберкулем до появления клинических симптомов болезни. В настоящее время рентгенофлюорография обычно проводится уже в связи с появлением клинических признаков болезни на более поздних ее стадиях. Возрождению массовой профилактической флюорографии в прежних масштабах сегодня препятствуют главным образом экономические причины. Исследование мокроты Новая стратегия заключается в первоочередном выявлении больных, выделяющих с мокротой микобактерии туберкулеза (МБТ) и являющихся источником распространения инфекции. Всем пациентам с длительным (более 2 нед) продуктивным кашлем необходимо исследовать мокроту на кислотоустойчивые палочки методом прямой бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю Нильсену. Проведение исследования осуществляют лаборатории поликлиник и общесоматических стационаров. Своевременная изоляция бактериовыделителей, проведение противоэпидемических мероприятий позволяют снизить риск распространения инфекции среди пациентов и работников медицинских учреждений. Туберкулинодиагностика Туберкулинодиагностика продолжает широко использоваться для выявления инфицирования туберкулезом детей и подростков. Проба Манту с 2 ТЕ проводится ежегодно в возрасте от 1 до 17 лет. Результаты ее оценивают через ч после внутрикожного введения туберкулина. Проба считается отрицательной при размере папулы 0 1 мм, сомнительной при 2 4 мм, положительной при 5 мм и более, гиперергической при 17 мм и более (у детей и подростков). В условиях массовой противотуберкулезной вакцинации детей, проводимой в нашей стране, для большинства детей характерна умеренно выраженная положительная туберкулиновая реакция. Отрицательный результат пробы Манту указывает на отсутствие у ребенка противотуберкулезного иммунитета и необходимость ревакцинации БЦЖ. Новая стратегия заключается в первоочередном выявлении больных, выделяющих с мокротой микобактерии туберкулеза. Увеличение размеров папулы на 5 мм и более за год или переход туберкулиновой реакции из отрицательной в положительную ( вираж ) без проведения ревакцинации БЦЖ свидетельствует о произошедшем инфицировании ребенка туберкулезом и о необходимости дообследования у фтизиопедиатра.

5 Результаты определения кожной туберкулиновой чувствительности у взрослых не могут быть использованы для выявления туберкулеза в силу того, что к 40_летнему возрасту показатель инфицированности здоровых россиян достигает 90%. Проба Манту у взрослых позволяет получить информацию о состоянии противотуберкулезного иммунитета. Отрицательный и сомнительный результаты пробы могут свидетельствовать об отсутствии заражения туберкулезом либо о тяжелом подавлении иммунитета у больного с наличием или отсутствием туберкулеза. Выраженная положительная реакция (более 12 мм) или туберкулиновая гиперергия, о которой свидетельствуют папула 21 мм и более у взрослых, наличие везикулы, некроза, регионарного лимфангита, характерны для больных активным туберкулезом. Подтверждение диагноза Диагностика туберкулеза в клинике внутренних болезней часто вызывает затруднения в связи с многообразием его клинических форм. Основными задачами диагностики при подозрении на туберкулез являются подтверждение этиологии болезни, уточнение распространенности и активности процесса. Обследование пациента при подозрении на туберкулез начинается с проведения стандартного комплекса исследований (обязательного диагностического минимума), который включает изучение анамнеза, жалоб, врачебный осмотр, рентгенографию грудной клетки в прямой и боковой проекциях, трехкратное бактериоскопическое исследование мокроты, собранной за сутки, на МБТ с одновременным ее посевом на питательные среды, гемограмму и туберкулиновую пробу Манту с 2 ТЕ. Следует уточнить, не болел ли пациент туберкулезом ранее, узнать о возможных контактах с больными туберкулезом, наличии туберкулеза у родственников, сопутствующих заболеваниях, повышающих риск развития туберкулеза. Клинический симптомокомплекс, характерный для туберкулеза, представлен синдромом воспалительной интоксикации (повышением температуры тела, ознобом, потливостью, учащенным сердцебиением, слабостью, повышенной утомляемостью, ухудшением аппетита, похуданием) и бронхолегочными симптомами (кашлем, выделением мокроты, кровохарканьем, болью в груди, одышкой). Выраженность клинических проявлений туберкулеза может варьировать от полного отсутствия до максимальной. Обычно выраженность клинической картины соответствует распространенности легочного процесса. Рентгенологические методы

6 Рентгенологическое исследование традиционно занимает важное место в диагностике туберкулеза органов дыхания, его результаты обычно позволяют установить предварительный диагноз. Все многообразие специфических изменений, выявляемых у больных, складывается из элементов, схематично представленных на рисунке. Перечисленные элементы могут быть единичными или множественными, заметно варьировать по размерам, морфологии, интенсивности и встречаться в самых разных сочетаниях. При длительном течении туберкулеза рентгенологическая картина может также дополняться признаками пневмофиброза, эмфиземы, бронхоэктазов. Важным для диагностики является наличие остаточных изменений перенесенного туберкулеза: кальцинированных очагов в легких и/или внутригрудных лимфатических узлах. Уточнение распространенности, морфологических особенностей поражения органов дыхания осуществляется с помощью методов простой и компьютерной томографии, радиоизотопных исследований, эхографии плевральных полостей и субплеврально расположенных образований в легких. Рентгенологические проявления туберкулеза органов дыхания Микробиологические методы Диагноз туберкулеза, предполагаемый на основании клиники, анамнеза, характерной рентгенологической картины, лабораторных признаков воспалительной активности и результатов туберкулиновой пробы, считается подтвержденным при микроскопическом обнаружении МБТ в 2 из 3 проб мокроты. Положительный результат микроскопии мокроты на МБТ свидетельствует о массивном бактериовыделении. Разрешающая способность метода позволяет обнаружить МБТ при наличии нескольких сот тысяч их в 1 мл исследуемого материала. Бактериовыделители составляют более 1/3 всех впервые выявленных больных туберкулезом органов дыхания. Пациенты, у которых диагноз туберкулеза не удалось подтвердить обнаружением МБТ в мокроте при стандартном исследовании, нуждаются в дополнительном обследовании. Повторные бактериоскопические и культуральные исследования мокроты, промывных вод, аспирата из бронхов, бронхоальвеолярного смыва, крови, в том числе с использованием системы БАКТЕК, направлены на обнаружение МБТ, L-форм возбудителя; определение лекарственной чувствительности.

7 Полимеразная цепная реакция Присутствие ДНК МБТ можно установить в исследуемом материале с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая в последние годы стала доступной и используется все шире. Метод обладает высокой чувствительностью он позволяет обнаруживать возбудитель при содержании всего нескольких сотен микроорганизмов в 1 мл исследуемого материала (мокроты, крови, плеврального выпота и т.д.). Результат исследования можно получить в течение 5 6 ч. Однако существует ряд причин, препятствующих широкому использованию ПЦР для достоверной верификации диагноза туберкулеза. Предлагаемые отечественные и зарубежные модификации тест-систем для постановки ПЦР значительно различаются по чувствительности и специфичности, что не позволяет получать стандартизированный результат. Этот высокочувствительный метод в ряде случаев может давать ложноположительные результаты, что ограничивает достоверность исследования. ПЦР целесообразно применять в комплексе с традиционными методами лабораторной диагностики туберкулеза. При получении положительного ответа ПЦР, противоречащего результатам других исследований, желательно повторить постановку реакции. Определение антител к МБТ Определение противотуберкулезных антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) не имеет самостоятельного диагностического значения, что обусловлено недостаточной чувствительностью и специфичностью метода. В то же время значительное повышение уровня антител к МБТ в крови, определяемое количественным методом, является аргументом в пользу туберкулезной этиологии процесса при анализе результатов комплексного обследования. Уточнение активности процесса Уточнение активности туберкулезного процесса может потребоваться в случаях, когда в легких на рентгенограмме обнаруживаются характерные для туберкулеза изменения, но отсутствуют бактериовыделение и достоверные признаки активного воспаления. Такая ситуация характерна для пациентов: с ограниченными впервые выявленными изменениями в легких; с остаточными изменениями перенесенного ранее туберкулеза и подозрением на рецидив болезни; при хроническом торпидном течении туберкулеза.

8 Изменения гемограммы обычно отражают наличие активного воспалительного процесса (лейкоцитоз, палочкоядерный сдвиг, лимфопения, моноцитоз, увеличение СОЭ), однако они весьма вариабельны, могут отсутствовать у пациентов в начальной фазе ограниченного легочного процесса или быть обусловленными наличием сопутствующих заболеваний (например, обострением хронического бронхита). Активность воспалительного процесса при туберкулезе можно уточнить на основании оценки изменений протеинограммы, острофазовых белков, уровня противотуберкулезных антител и антигенов МБТ в крови; состояния клеточного иммунитета; углубленной туберкулинодиагностики с постановкой градуированной туберкулиновой пробы и подкожным введением ТЕ туберкулина (проба Коха). Дифференциальная диагностика Необходимость дифференциальной диагностики обычно возникает, когда: имеет место атипичное проявление заболевания; полученные результаты обследования характерны для нескольких альтернативных заболеваний; имеется сочетание нескольких заболеваний бронхолегочной системы туберкулезной и нетуберкулезной природы (туберкулез и пневмония, туберкулез и рак и др.); допущена неправильная трактовка результатов обследования; отсутствует адекватный ответ на лечение. Проведение дифференциальной диагностики подразумевает получение дополнительной информации, которая используется не только для подтверждения или исключения туберкулезной этиологии процесса, но и для диагностики альтернативного заболевания. Помните: «Туберкулез излечим! Правильное лечение залог выздоровления!

Туберкулез и микобактериоз. Общая информация

Туберкулез у человека вызывают микобактерии туберкулеза (МБТ): M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum, M.microti, M.canettii, M.caprae, M.pinnipedii, M. mungi, объединяемые в группу микобактерий, называемую Mycobacterium tuberculosis complex, к которой также относится вакцинный штамм M.bovis BCG. Преобладающим этиологическим агентом является M.tuberculosis. Кроме абсолютно-патогенных для человека микобактерий, к которым кроме МБТ относится микобактерия лепры, существуют еще нетуберкулезные микобактерии (НТМБ), около 30 видов которых являются условно-патогенными для человека, прочие являются сапрофитами. Все НТМБ являются убиквитарными – т. е. повсеместно распространенными в окружающей среде.

Микобактерии (МБ) отличаются высокой устойчивостью к воздействию физикохимических факторов. До полугода они могут сохраняться на объектах окружающей среды, в пыли, на страницах книг, в почве и воде, причем высушивание увеличивает их жизнеспособность. В высушенной мокроте МБТ сохраняют жизнеспособность в течение 10–12 месяцев и погибают при нагревании до 100. С только через 45 мин, а при 70. С – через 7 часов. Низкие температуры также способствуют сохранению жизнеспособных МБ – в масле и сыре при низких температурах они живут до 1 года.

Туберкулез (ТБ) – антропозоонозное инфекционное гранулематозное заболевание. Передается в большинстве случаев аэрогенным (воздушно-капельным или воздушно-пылевым), но встречаются также алиментарный, контактный и трансплацентарный пути заражения. Следует помнить о возможности перекрестного заражения ТБ человека и животных. Микобактериоз – заболевание, вызванное другими представителями рода Mycobacterium – НТМБ, которые могут передаваться от человека к человеку, но основным источником инфицирования служат сельскохозяйственные животные.

Оба заболевания характеризуются политропностью, т. е. в организме человека и животных при развитии патологического процесса могут поражаться различные органы. Более чем в 80% случаев развивается легочная форма заболеваний, в остальных случаях – внелегочная или сочетанные формы. Внелегочный ТБ, как правило, развивается вторично, в результате распространения туберкулезной инфекции из первичного очага, локализующегося обычно в органах дыхания. При этом первичный ТБ может быть отсроченным по времени с эпизодом проявления внелегочного ТБ и разрешиться ранее, либо вследствие проведения противотуберкулезной терапии, либо самостоятельно, без ее применения.

Заболеваемость туберкулезом в Российской Федерации в настоящее время высокая: 82,4–84,0 на 100 тыс. населения. Растет и число больных с резистентными к стандартной терапии штаммами МБТ. Особую угрозу туберкулез представляет для больных с иммунодефицитными состояниями, при которых он может протекать атипично, создавая трудности для клинико-лабораторной диагностики.

Среди контингента больных ВИЧ-инфекцией в РФ постоянно увеличивается число больных с поздними стадиями ВИЧ-инфекции. Это приводит к тому, что у все большего числа больных ВИЧ-инфекцией россиян, инфицированных МБТ, на фоне иммунодефицита развивается туберкулез. При этом туберкулез – главная причина смерти умерших от причин, связанных с ВИЧ-инфекцией (63,4% в 2010 г. по данным МЗ РФ). Европейское региональное бюро ВОЗ относит Россию к числу стран с наиболее неблагоприятной ситуацией по туберкулезу, сочетанному с ВИЧинфекцией.

Наиболее частыми этиологическими причинами микобактериозов у больных ВИЧ-инфекцией является Mycobacterium avium complex, M. xenopi, M. kansasii, M. fortuitum. Клинические формы этих поражений развиваются исключительно у лиц с выраженным иммунодефицитом. Диагностика легочного и внелегочного ТБ, а также микобактериоза, зависит от настороженности врачей, в первую очередь общей лечебной сети, а также доступности специальных методов исследования. Согласно приказу № 1224н от 29 декабря 2010 г. медицинские работники любых специальностей медицинских организаций РФ должны выявлять симптомы туберкулеза. При подозрении на туберкулез органов дыхания или внелегочной локализации в медицинских организациях проводится лабораторное исследование разных видов биологического материала, преимущественно – выявление возбудителя заболевания методом микроскопии.

Для защиты от ТБ применяется вакцинация, проведение которой регулируется федеральным законодательством. Вакцина представляет собой аттенуированный штамм M.bovis – M.bovis BCG. В ряде случаев вакцинация может вызывать осложнения, т.н. БЦЖ-иты.

ТБ в мире классифицируется в соответствии с МКБ-10, которая учитывает лишь метод подтверждения диагноза и локализацию процесса, и определяется кодами А15 – А19. В России существует собственная классификация, отражающая клинико- морфологические особенности патогенеза. В ее основу положены несколько принципов: клинико-рентгенологические особенности туберкулезного процесса (в т. ч. локализация и распространенность), его течение (т. е. фазы), а также наличие бактериовыделения. В приказе Минздрава РФ от 21.03.2003 № 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации» сделана попытка совмещения обеих классификаций, когда к 4 знакам шифра МКБ-10 добавлено еще 6 знаков, в которых нашли отражение уточнения отечественной классификации.

Заболевания, вызванные НТМБ, а также другими представителями порядка Actinomycetales, имеющими близкое генетическое, иммунологическое, хемотаксономическое родство с МБ, микроорганизмами родов Nocardia, Rhodococcus, Corynebacterium и др., имеют сходную с ТБ локализацию патологического процесса, а также клиническую, в ряде случаев микробиологическую, и на определенных этапах патогенеза – морфологическую картины. Такие заболевания могут протекать под маской ТБ, что затрудняет его дифференциальную диагностику. Увеличивающееся в последнее время количество случаев заболеваний, вызванных подобными возбудителями, обусловлено увеличением количества иммунокомпрометированных лиц, а также развитием бактериологических и молекулярно-биологических методов исследования. Вопросы диагностики и лечения таких больных на законодательном уровне в РФ четко не обозначены.

Показания к обследованию

  • Лица, проживающие в домах престарелых, беженцы, мигранты, лица, освободившиеся из мест лишения свободы, БОМЖ, пациенты наркологических и психиатрических учреждений;
  • пациенты с различными сопутствующими заболеваниями и иммуносупрессией: профессиональными заболеваниями легких, сахарным диабетом, язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, больные ВИЧ-инфекцией, лица с первичными иммунодефицитами, а также получающую цитостатическую, гормональную или лучевую терапию, женщины в послеродовом периоде;
  • больные с длительным (более 2 недель) кашлем, а также лица с кровохарканьем, болью в груди, одышкой; дети и подростки, у которых методом туберкулинодиагностики (с последующим подтверждением Диаскинтестом или IRGA-тестом (OFT-IT)) был получен положительный результат исследования;
  • лица, у которых отмечены гиперергические реакции на туберкулин;
  • лица, находившиеся в контакте с больными ТБ, а также работающие в хозяйствах, неблагополучных в эпидемическом плане по заболеваемости ТБ крупного рогатого скота и птиц, либо проживающие на территории этих хозяйств;
  • лица, у которых при обследовании обнаруживаются очаговые образования в различных органах (тканях);
  • лица, у которых при обследовании обнаруживаются выпоты неясной этиологии в плевральной полости, а также в других серозных полостях (после исключения опухолевой природы выпота);
  • лица с симптомами общей интоксикации (субфебрилитет в вечернее время, потливость, слабость), продолжающимися 2 недели и более;
  • лица с хроническими воспалительными заболеваниями различных органов, у которых наблюдаются частые (более 2-х раз в год) обострения и отсутствие выраженной положительной динамики на проводимое противовоспалительное лечение в течение более 3-х недель;
  • лица, у которых при проведении диагностических исследований возникают сомнения в правильности установленного диагноза, или лица, которым однозначный диагноз установить не удается.

Дифференциальная диагностика. Первичная форма ТБ с поражением внутригрудных лимфатических узлов: саркоидоз I стадии, лимфогранулематоз, микобактериоз, лимфолейкоз, лимфосаркома, ретикулосаркома, центральный рак легкого, застойные изменения в легких на фоне сердечной недостаточности.

Диссеминированный ТБ: саркоидоз II стадии, бактериальная пневмония, профессиональные заболевания легких – пневмокониоз (силикоз и силикатоз, металлокониоз, карбокониоз, пневмокониоз, вызванные смешанной или органической пылью), микобактериоз, канцероматоз легких, фиброзирующий альвеолит, коллагенозы, гистиоцитоз Х, гемосидероз, криптококкоз, аспергиллез, гистоплазмоз, кокцидиоидоз, бластомикоз, гранулематоз Вегенера, хроническая интерстициальная пневмония, альвеолярный протеиноз, легочный васкулит.

Очаговый, инфильтративный ТБ и казеозная пневмония: внебольничная пневмония, периферический и центральный рак легкого, эозинофильный инфильтрат, актиномикоз легкого, нокардиоз, микобактериоз, ателектаз легкого, инфаркт легкого.

Кавернозный и фиброзно-кавернозный ТБ: абсцесс легкого, рак легкого с распадом, солитарные кисты легкого, бронхоэктазы, микобактериоз, нокардиоз.

Цирротический ТБ: саркоидоз III стадии и пневмофиброзы различной этиологии.

В случае округлых образований, наблюдаемых при рентгенологическом исследовании: периферический и метастатический рак, доброкачественные опухоли, эхинококкоз, аспергиллома, ретенционные кисты легкого, ограниченный осумкованный плеврит и артериовенозная аневризма легкого.

ТБ периферических лимфоузлов: саркоидоз, токсоплазмоз, микобактериоз, бруцеллез, болезнь Кикучи (гистиоцитарный некротизирующий лимфаденит), доброкачественный лимфоретикулез, лимфогранулематоз, неходжкинская лимфома.

У больных ВИЧ-инфекцией: вторичные заболевания, протекающие с поражением легких, генерализованные вторичные инфекции, онкологические поражения.

Материал для исследования

Мокрота, трахеальный смыв, материалы, полученные при проведении бронхоскопии – промывные воды бронхов, бронхоальвеолярный лаваж, а также материалы катетер- или щеточной биопсии, промывные воды желудка, экссудаты и транссудаты, гной, отделяемое ран, аспираты и пунктаты, спинномозговая и асцитическая жидкости, цельная кровь, моча, кал, секрет простаты, эякулят, менструальная кровь, ткани, в т.ч. фиксированные или в парафиновых блоках, смывы с предметов окружающей среды, а также культуры микроорганизмов, полученные при посеве этих видов материала для идентификации вида МБ.

Лабораторная диагностика туберкулеза и микобактериоза включает визуализацию кислото- и спиртоустойчивых бактерий при использовании микроскопии, получение первичной культуры или обнаружение ДНК/РНК МБ, их дальнейшее видовое дифференцирование и определение чувствительности возбудителя заболевания к противотуберкулезным препаратам культуральным методом или МАНК.

Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики и особенности интерпретации их результатов. По международным стандартам диагноз ТБ должен быть подтвержден бактериологически или гистологически.

Первоначальное исследование – микроскопия препарата мокроты или других жидкостей и тканей организма, взятых максимально близко к предполагаемой локализации патологического процесса. Микроскопия препарата с окраской по Цилю-Нильсену – быстрый, дешевый, но низко чувствительный метод (с его помощью можно обнаружить 105–106 микробных тел/мл), обладающий невысокой специфичностью, выявляющий все кислото- и спиртоустойчивые микроорганизмы. Метод не позволяет дифференцировать МБТ от НТМБ и, в ряде случаев, от других микроорганизмов порядка Actinomycetales. Диагностическая чувствительность метода составляет 20–65%.

Люминесцентная микроскопия препарата с окраской флуорохромными красителями – более чувствительный метод, т. к. позволяет проводить исследование при меньших увеличениях микроскопа и, следовательно, просматривать значительно больше полей зрения, чем при обычной микроскопии с иммерсионной системой при окраске по Цилю-Нильсену, что позволяет увеличить процент положительных находок на 10–17%.

Бактериологический посев на плотные питательные среды обладает большей чувствительностью и выявляет 100–1000 микробных тел/мл. Согласно стандартам микробиологической диагностики, обязательный посев проводится на 2 питательные среды, одной из которых является яичная среда Левенштейна-Йенсена (по рекомендации ВОЗ). В результате медленного роста, когда каждое деление микобактерий, в зависимости от вида, происходит через 2–24 ч, для получения результата требуется от 7 дней для быстрорастущих и до 2–12 недель для медленнорастущих, в число которых входит и МБТ.

Посев на жидкие питательные среды с помощью автоматических анализаторов BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD) и VersaTREK Myco (Trek Diagnostic Systems, Westlake, OH), позволяет получить результат через 4–42 дня.

Выявление ДНК или РНК МБ при использовании МАНК – наиболее чувствительные и специфичные методы лабораторной диагностики ТБ. Их использование повышает диагностическую эффективность исследования материала на 20-90%, при этом длительность анализа составляет 3–6 часов. В клинической практике чаще всего используют метод ПЦР. Технология ПЦР в реальном времени позволяет проводить не только обнаружение ДНК МБТ, но и определение ее количества. Как правило, аналитическая чувствительность наборов реагентов достигает 1–5 .. 102 микробных тел (КОЕ)/мл, аналитическая специфичность – 100%. Диагностическая чувствительность наборов разных производителей колеблется от 54 до 100%, специфичность составляет 90–100%.

В 2010 году в документах CDC, МАНК, наряду с культуральным методом, предложено использовать для подтверждения диагноза туберкулеза. В то же время, использование методов микроскопии ограничивается и предлагается для применения только в случаях невозможности проведения посева, при получении ложноотрицательного результата посева или его контаминации (пророста). Модификация программного обеспечения «Vercrit», используемого в противотуберкулезной службе США, выстраивает следующую иерархию доказательной диагностики ТБ:

  • положительный результат культурального исследования; положительный результат МАНК;
  • положительный результат микроскопического исследования препарата с окраской по Цилю-Нильсену;
  • положительные результаты совокупности клинических критериев, а именно: пробы Манту или IGRA-теста, рентгенологического исследования, результатов терапии с использованием не менее 2-х противотуберкулезных препаратов, при условии наличия заключений по всем диагностическим манипуляциям к моменту постановки диагноза.

Трехкратное взятие и исследование образцов биологического материала у пациента, например мокроты, увеличивает возможность обнаружения МБТ на 2–5%. Поэтому в отечественных и зарубежных руководствах по диагностике ТБ указана необходимость трехкратного, или, по меньшей мере, двукратного исследования образцов мокроты. Сбор первого образца мокроты проводится в присутствии среднего медицинского персонала для объяснения правильной последовательности действий пациента. Второй образец больной собирает вечером того же дня, а третий утром, после чего приносит их в лабораторию. В случае госпитализации больного образцы собираются последовательно в течение 3-х дней.

Вместе с тем, обнаружение МБТ в экскретируемых организмом жидкостях не всегда возможно даже при многократном сборе и исследовании материала методом ПЦР, что связано с преимущественно тканевой локализацией возбудителя ТБ. Поэтому в сложных диагностических случаях больным показано проведение гистологической диагностики ТБ. Образец ткани из очага патологического процесса, после проведения гистологической проводки и заключения его в парафин, можно исследовать как для верификации специфического туберкулезного воспаления, так и для подтверждения этиологической причины патологического процесса. Исследования проводят с помощью окраски бактерий по Цилю-Нильсену, иммуногистохимического исследования, позволяющего отнести обнаруженные микроорганизмы к роду Mycobacterium, а также МАНК, определяющих их видовую принадлежность.

С целью дифференцирования МБ до вида, необходимого для правильного определения этиологии заболевания, анализируют морфологические характеристики выросшей культуры, проводят ее микроскопическое исследование с окраской препаратов по Цилю-Нильсену, после чего осуществляют биохимические тесты и пересев на селективные питательные среды. Такая стратегия требует много времени как для получения достаточного для анализа роста культуры, так и для осуществления используемых методик. Однако даже применение всех методов позволяет дифференцировать МБ с точностью, не превышающей 95%, что связано с индивидуальными особенностями штаммов.

Дифференцирование до вида целесообразнее осуществлять с помощью молекулярно- биологических методов: ПЦР; гибридизация с ДНК-зондами, выявляющая наиболее распространенные МБ; высокоэффективная жидкостная хроматография, сравнивающая профиль жирных кислот клеточной стенки анализируемого микроорганизма с имеющимися в базе данных; секвенирование 16S rDNA и ITS-региона МБ, результаты которого анализируются с помощью интернет-ресурса RIDOM ( http://rdna.ridom.de ). Для дифференцирования некоторых НТМБ, особенно быстрорастущих (M.fortuitum, M.abscessus, M.chelonae), обязательно ориентируются на данные антибиотикочувствительности и результаты секвенирования. Практически для всех технологий, за исключением ПЦР, в качестве материала для исследования применимы только первичные культуры МБ, выросших на плотных или жидких питательных средах

Не менее важно дифференцирование до вида внутри группы Mycobacterium tuberculosis complex. Это связано с необходимостью определения источника заболевания, определения дальнейшей тактики противотуберкулезной терапии (при индикации М.bovis или ее вакцинного штамма М.bovis BCG, которые отличаются природной резистентностью к одному из основных ПТП – пиразинамиду, этот препарат не назначается), а также для подтверждения поствакцинальных осложнений у пациента. МР № 99/219 «Диагностика поствакцинальных осложнений после введения вакцины БЦЖ» предлагают с этой целью использовать диагностический комплекс, предусматривающий последовательное применение двух методов: культурального и ИФА для обнаружения АГ полученной культуры с помощью моноклональных АТ, специфически взаимодействующих с поверхностными АГ М.bovis, но не связывающимися с АГ М.tuberculosis. Исследование включает определение морфологических особенностей штамма, его тинкториальных свойств, спирто- и кислотоустойчивости, видовой принадлежности и изучение его лекарственной чувствительности к ПТП с обращением особого внимания на чувствительность к пиразинамиду. Несмотря на то, что в МР написано, что использование диагностического комплекса при морфологической верификации диагноза позволяет в 100% случаев верифицировать диагноз «БЦЖит», очевидно, что данные методы не позволяют дифференцировать М.bovis от ее вакцинного штамма М.bovis BCG. С этой задачей успешно справляется набор реагентов, основанный на использовании метода ПЦР, который выявляет виды M.tuberculosis complex: M.tuberculosis, M.bovis и ее вакцинный штамм M.bovis BCG и др. непосредственно в разных видах биологического материала.

Для определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) МБ к противотуберкулезным препаратам с помощью культурального метода используют первичную культуру МБ. Существует 3 основных метода непрямого определения ЛЧ МБ: метод пропорций, метод коэффициента устойчивости и метод абсолютных концентраций на плотных и жидких средах. В России и большинстве стран мира наиболее распространенным и традиционно используемым методом определения ЛЧ МБ является непрямой метод абсолютных концентраций на плотной яичной питательной среде Левенштейна–Йенсена. Остальные методы определения ЛЧ МБТ являются альтернативными. Основным недостатком традиционных культуральных методов определения ЛЧ МБТ, является их чрезвычайная длительность. Результаты исследования ЛЧ первичной культуры МБ учитываются через 3–4 недели инкубации для плотных и 4-13 дней для жидких питательных сред, поэтому необходимая коррекция химиотерапии может быть проведена не ранее, чем через 10–60 дней или 40–120 дней, в зависимости от используемых питательных сред, от момента поступления в лабораторию диагностического материала.

Определение ЛЧ с помощью молекулярно-биологических методов основано на выявлении мутаций, ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости к ПТП. Основное преимущество таких методов заключаются в скорости получения результатов анализа – 1–2 дня, что достигается вследствие возможности использования для тестирования непосредственно клинического материала, хотя возможно использование также и первичной культуры.

Необходимо учитывать, что наборы реагентов, основанные на применении разных методов, характеризуются разными показателями чувствительности и специфичности. Гибридизационные технологии, такие как ДНК-микрочипы, могут обнаруживать только конкретные мутации, внесенные в дизайн диагностических наборов и/или дикий тип МБТ. Их диагностическая чувствительность в значительной степени зависит от спектра генетических изменений штаммов МБТ, характерных для данного географического региона, в случае наличия других мутаций исследование будет давать ложноотрицательные результаты.

Метод секвенирования является «золотым стандартом» в молекулярной диагностике, он может определять любые изменения в нуклеотидной последовательности, в т. ч. протяженные инсерции и делеции. На сегодняшний день выпускаются наборы реагентов, а также специальное программное обеспечение, автоматизирующее процесс получения результатов.

Косвенные методы клинической и лабораторной диагностики ТБ, к которым относятся рентгенодиагностика, компьютерная томография, кожные тесты: туберкулинодиагностика (реакция Манту) и Диаскинтест® (Фармстандарт), а также — интерфероновые тесты (IGRA), не обнаруживают непосредственно МБТ, поэтому не могут достоверно диагностировать ТБ, однако могут дать информацию о наличии изменений в органах больного или о напряженности противотуберкулезного иммунитета.

Из вышеназванных исследований тестами лабораторной диагностики in vitro являются IGRA, в настоящее время представленные наборами QFT-IT и T-SPOT. TB. Исследование основано на стимуляции мононуклеарных клеток пациента антигенами, специфичными для M.tuberculosis complex, в ответ на которую высвобождается гамма-интерферон (IFN-.). АГ представлены секреторным белком 6-kDa early-secreted antigenic target (ESAT-6), его шапероном 10-kDa culture filtrate protein (CFP-10), а также дополнительным туберкулезным протеином TB 7.7 (p4) (только в наборе QFT-IT). Эти белки отсутствуют у всех вариантов вакцинного штамма M.bovis BCG и большинства НТМБ, за исключением M.kansasii, M.marinum, M.szulgai, M.flavescens и M.gastrii. Следовательно, оба теста всегда будут давать отрицательный результат при поствакцинальной аллергии или БЦЖ-ите, и ложноположительный результат при наличии в организме НТМБ: M.kansasii, M.marinum или M.szulgai, имеющих клиническое значение.

Тесты IGRA не могут дифференцировать у человека состояние инфицированности МБТ (латентный ТБ) и активный ТБ. Их результаты должны оцениваться совместно с клиническими и рентгенологическими данными, сведениями о контактах, микробиологическими исследованиями и т. д. Особое значение приобретает использование тестов IGRA в странах, где проводится вакцинация БЦЖ. В случае положительной пробы Манту и отрицательном результате теста IGRA у пациента достоверно подтверждается состояние поствакцинальной аллергии. При конверсии результатов теста IGRA, т. е. при изменении отрицательного результата на положительный, риск последующего развития активного туберкулезного процесса не увеличивается. У иммуносупрессивных пациентов IGRA-тесты, как и проба Манту, будут отрицательными, что не может исключить у них активного туберкулезного процесса.

Наиболее удобно применять тесты IGRA у пациентов, ранее вакцинированных против ТБ, у лиц, имеющих противопоказания к проведению кожного теста, у детей, а также у тех пациентов, которым сложно попасть на повторный прием к врачу через 72 часа для определения результатов пробы Манту. В зарубежной практике тесты IGRA используют вместо или вместе с пробой Манту, во многих странах такие исследования закреплены законодательно.

IGRA-тесты являются качественными, их результаты выдаются в категориях: положительный, отрицательный и неопределенный.

Положительный результат означает текущую инфекцию МБТ, но не позволяет дифференцировать недавнее инфицирование МБТ от ранее произошедшего, а также оценить степень активности туберкулезного процесса.

Отрицательный результат чаще означает отсутствие МБТ в организме человека, но может наблюдаться и при супрессии Т-клеточного звена иммунной системы, наступившей вследствие иммунодефицитного состояния, в т. ч. и при прогрессировании туберкулеза. В этом случае следует ориентироваться на результаты прямых методов исследования, подтверждающих специфическую природу заболевания.

В редких случаях результаты тестов не могут быть интерпретированы вследствие не прохождения положительного контроля теста и оцениваются как неопределенные. В этом случае нельзя ни подтвердить, ни исключить туберкулезную инфекцию.

Следует помнить, что у части больных не удается обнаружить МБТ традиционными микробиологическими методами и даже методом ПЦР (если не проводится биопсийный забора материала). В этих случаях диагноз ТБ будет основываться на клинических данных, результатах косвенных методов диагностики и терапии ex juvantibus, а принимаемые по этому поводу решения полностью зависят от квалификации и опыта врача-фтизиатра. Вследствие этого, учитывая биологические особенности микроорганизма, а также иммунного ответа организма человека, диагностика ТБ не может ограничиваться каким-либо одним методом и должна проводиться комплексно.

Показания к применению лабораторных исследований для диагностики туберкулеза у больных ВИЧ-инфекцией и особенности интерпретации их результатов. Основной принцип диагностики туберкулеза у больных ВИЧ-инфекцией такой же, как и у пациентов с ВИЧ-негативным статусом – выявление достоверных признаков специфического воспаления (детекция возбудителя либо морфологическая верификация).

Самым важным в диагностике туберкулеза у больных ВИЧ-инфекцией является выявление возбудителя. У этой категории больных частота выявления МБТ из мокроты уменьшается по мере снижения количества CD4+лимфоцитов (ввиду снижения регистрации деструктивных форм). Однако при глубоком иммунодефиците (менее 100 клеток/мкл), вероятность обнаружения МБТ повышается (за счет огромного количества возбудителя в легочной ткани). Важно отметить, что у больных полиорганным туберкулезом не менее ценным, чем исследование мокроты, является выявление возбудителя в другом диагностическом материале. Поэтому необходим обязательный поиск МБТ в любых биологических жидкостях и биопсийном материале. Также для детекции МБТ целесообразно применять молекулярно-биологические методы, чувствительность и специфичность которых значительно превосходит традиционные микробиологические методы.

Туберкулиновая чувствительность у больных с активным туберкулезом на фоне ВИЧ-инфекции снижается по мере прогрессирования иммунодефицита, и у пациентов с количеством CD4+лимфоцитов менее 100 клеток/мкл частота регистрации положительной пробы Манту с 2 ТЕ не превышает 10%, а при количестве CD4 клеток более 500/мкл она сопоставима с группой больных без ВИЧ-инфекции (до 95%). Проведенные клинические исследования показали, что при высокой специфичности Диаскинтеста (до 100%), чувствительность этого диагностического метода также снижается по мере уменьшения количества CD4+лимфоцитов и сопоставима с чувствительностью реакции Манту.

При неинформативности туберкулинодиагностики, Диаскин- и IGRA-тестов, снижении вероятности выявления МБТ в мокроте и расширении дифференциально- диагностического ряда за счет других вторичных заболеваний в диагностике специфического процесса важную роль приобретает малоинвазивная хирургия с целью морфологической верификации туберкулезного процесса. Морфология туберкулезного воспаления тесно связана с состоянием иммунной системы больного и в значительной степени зависит от него. Гистоморфологические проявления туберкулезного воспаления при ВИЧ-инфекции утрачивают свои специфические признаки по мере ее прогрессирования. У больных с количеством СD4+лимфоцитов более 350 клеток/мкл сохраняется способность к формированию типичной гранулематозной реакции. В биоптатах пациентов с более тяжелой степенью иммуносупрессии (число СD4+лимфоцитов 200–350 в мкл) преобладает несовершенная стертая гранулематозная реакция. Это свидетельствует о смене реакции гиперчувствительности замедленного типа, типичной для туберкулеза, реакцией гиперчувствительности немедленного типа. Состояние выраженного иммунодефицита (при количестве СD4+лимфоцитов менее 200 клеток/мкл), характеризуется в большинстве случаев некротическими изменениями с выраженным экссудативным компонентом воспаления. Однако при проведении микроскопии препаратов биопсии с окраской по Циль-Нильсену обнаруживаются кислотоустойчивые бактерии в большом количестве (20-50 и более в одном поле зрения). В связи с этим у больных ВИЧинфекцией, особенно на фоне выраженной иммуносупрессии, важно проведение комплексного поэтапного изучения биопсийного материала с проведением микроскопии препаратов с окраской по Цилю-Нильсену, микроскопических исследований с применением методов иммуногистохимии (использование моноклональных АТ к M. tuberculosis) и ПЦР для выявления ДНК МБТ в нативном материале и из парафиновых гистологических блоков. Обнаружение микобактерий в кале, мокроте или бронхоальвеолярном лаваже при отсутствии клинической симптоматики может свидетельствовать только о колонизации слизистых оболочек.

Другие публикации:  Повторная флюорография пневмония